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Seminario Transporte dependiente de proteólisis de las SREBP

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by

Gian Luca Borrone Martinez

on 6 April 2014

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Transcript of Seminario Transporte dependiente de proteólisis de las SREBP

se observo que...
Al aumentar la concentración de esteroles SREBP y SCAP se unen formando un complejo para captarlos.

. Al disminuir la concentración de esteroles SCAP escolta SREBP a un compartimiento post RE para que sea escindido por S1P.
. SCAP es necesario para la escisión de SREBP .
Experimento 1: Inmunotransferencia de la supresion de la division SREBP en celulas CHO por Brefeldina A en ausencia y presencia de esteroles.
Conceptos Clave
.
SREBP
(Proteína reguladora de unión a los esteroles).Regula la homeostasis de colesterol.

SCAP
(proteína de unión a SREBP) censa la cantidad de esteroles libres, actúa en la regulación alostérica de unión a los esteroles y escolta a SREBP a Golgi.

Experimento 2: Inmunotransferencia con células que caracen de SCAP o de S1P las cuales fueron tratadas con Brefeldina A.
Experimento 6: Analisis de células SRD-12B con S1P-KDEL Y S1P-KDAS por inmunoblot.
S1P al presentar la secuancia KDEL, hace que los receptores de KDEL devuelvan S1P al RER desde el Golgi, haciendo que SERBP-2 se escinda en el RER lo que no es regulada por esteroles.
Seminario Transporte dependiente de proteólisis de las SREBPs
La relocación de la proteasa de Sitio 1 del Golgi al RER obvia la necesidad de transportar SRBEP al aparato de Golgi

S1P

(proteasa del sitio uno de escisión) escinde SREBP en dos partes.
S2P

(proteasa del sitio dos de escisión) actúa después de S1P para escindir los grupos amino terminal de SREBP.
Brefeldina A
; Es un antibiotico que inhibe el transporte retrogrado de proteinas , en este caso actua sobre S1P.
Secuencia KDEL
: es una secuencia aminoacidica señal que hace que la proteina vuelva al reticulo rugoso y permanezca ahi.
Secuencia KDAS
: secuencia aminoacidica lys-Asp-Ala-Ser, que no es reconocida por los receptores KDEL

Los esteroles bloquean la escisión del sitio 1 mediante una reducción de la actividad de SCAP.

SCAP actúa escoltando a SREBP a un compartimiento post RE donde reside S1P y los esteroles bloquean este transporte.

Si se pudiera activar a S1P en el RE se debería obviar la necesidad de que SCAP escolte q S1P
Las celulas SRD-13A, son celulas las cuales se les ha mutado el gen que codifica SCAP,que hace que no pueda sintetizarlos.
La utilización de Brefeldina A hace que S1P permanezca en el RE sorteando la necesidad de que SCAP actúe.
Experimento 3: Técnica de Inmunofluorecsncia de células CHO/pS2P y celulas SRD-12B.
En las células CHO se observó por inmunofluorecencia una tinción positiva indicando la presencia de S1P en el aparato de Golgi, en cambio en las células SRD-12B la tinción fue negativa por lo que no hay S1P.
Experimento 4: Inmunofluorescencia de células CHO/pS2P en ausencia y presencia de Brefeldina A.
Con el uso de Brefeldina A la S1P no se marca en Golgi, en ausencia de ella pudimos observar que S1P esta situado en cis-medial Golgi pero no en trans
Experimento 5: Analisis de celulas
CHO con transfeccion de S1P
mediante inmunoblot.
S1p-C es la principal forma
activa de S1P en células no
transfectadas y S1P-B se
vuelve prominente
solo cuando la proteína se
sobre expresa como resultado
de la transfección.
La actividad de S1P-C no es alterada
por los niveles de esteroles sino por SCAP. S1P-C se encuentra en el Golgi.
Las celulas SRD-12B carecen
de SCAP
Experimento 7: Analisis de celulas carentes de SCAP a las cuales le fueron transfectadas Myc-KDEL, lo cual rescata la escision de SREBP.
A- Para que se produzca la
escisión de SREBP por parte
de S1P, éste necesita una
señal de reconocimiento
RSVL, que se encuentra en
el bucle terminal de SREBP.

B- SCAP no se necesita
para la escisión de
SREBP al expresarse
S1P-KDEL en el RER.

Conclusiones
Para que se produzca la escisión
del sitio 1 en SREBP se necesita
que SCAP lo escolte al Aparato de
Golgi. Este proceso esta reglado
por los esteroles.
Modelo ilustrando el requerimiento de SCAP para la escisión de SREBP:
. Cuando la célula esta agotada de esteroles, SCAP acompaña a SREBP a un
compartimiento post-RE, donde se
encuentra S1P activo.

Cuando la célula presenta altos niveles
de colesterol, el complejo SCAP/SREBP permanece en el RER, y nunca entran
en contacto
con la forma activa de S1P.
SCAP se mueve
desde el RE al
Aparato de Golgi
cuando se cultivan
tanto en ausencia
como en presencia
de esteroles.
S1P –C la forma activa de S1P, reside
en o cerca del Aparato de Golgi,
a lo igual que S2P.

El transporte retrógrado de S1P
provoca su actividad no regulada
por esteroles y obvia la necesidad
de que SCAP escolte a SREBP
al Golgi. (Brefeldina A, KDEL)
Como la escisión del sitio 1 se produce normalmente en un compartimento de Golgi, entonces la escisión del sitio 2 también debe darse en Golgi, obteniendo la forma nuclear de SREBP.
Cuando se trata con Brefeldina A
la escisión tanto del sitio-1, como
la escisión del sitio-2 se producen
en el RER.
Integrantes:

Andreina Lucchese
Matias Ifran
Gian Luca Borrone
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