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Reacão da polimerase em cadeia (PCR), PCR-Multiplex e Real-T

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by

Rita Santos

on 14 November 2013

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Transcript of Reacão da polimerase em cadeia (PCR), PCR-Multiplex e Real-T

Reacção da polimerase em cadeia (PCR), PCR-Multiplex e Real-Time-PCR
PCR, o que é necessário?
Cadeia de DNA alvo;

Primers;

Taq DNA polimerase;

dNTPs;

Termociclador;

Tampão da reacção (MgCl2)
Aplicações
Ciências forenses;
Filiação genética;
Detecção de mutações e polimorfismos;
Diagnóstico de doenças hereditárias e infecciosas (HIV);
Paleontologia;
Amplificação de sequências de DNA desconhecidas.
Vantagens
•Permite avaliar uma sequência precisa de DNA de forma rigorosa e com uma elevada especificidade e sensibilidade;
•Custo reduzido.

Inventada por Kary Mullis em 1983

Prémio Nobel da Química em 1993

Um pouco de história...
Introdução
A PCR é uma técnica que permite a rápida amplificação de uma sequência do DNA, de entre todo o genoma. Surge por oposição à clonagem de DNA baseada na utilização de células, que pressupunha o uso de vectores(ex:.plasmídeos), expressos em bactérias e posterior recolha do DNA das culturas que replicaram a sequência de interesse.
"Beginning with a single molecule of the genetic material DNA, the PCR can generate 100 billion similar molecules in an afternoon. The reaction is easy to execute. It requires no more than a test tube, a few simple reagents, and a source of heat." Kary Mullis
PCR simples, o processo

Desvantagens
•É necessário conhecer a sequência de DNA a amplificar;
•Facilidade de contaminação da amostra;
•Extensão da sequência a amplificar é limitada;
•É possível a ocorrência de incorporação errada de bases.

Real -Time PCR, simples
Quantificação
Absoluta: usada para quantificar amostras desconhecidas, interpolando a sua quantidade através de uma curva standard.
Standard curve:
Digital:
Relativa: é usada para analizar mudanças na expressão de genes numa dada amostra, relativamente a outra amostra de referência.
Vantagens
Desvantagens
PCR-Multiplex
O que é?
Tempo real;
Quantificação da amplificação da sequência de interesse logo que esta é detectada;
Fluorescência detectada é directamente proporcional à quantidade de DNA amplificado;
2 métodos de detecção: Sybr® Green 1 e TaqMan®


•Detecção em tempo real de sequências de interesse;

•Falsos positivos;
•Método de TaqMan requer síntese de sondas específicas para sequências específicas.
Aplicações
Identificação de alelos em DNA genómico;
Análise de agentes patogénicos em alimentos;
Análise de sequências virais ou bacterianas em diversos indivíduos.
O que é ?
Vantagens
Desvantagens
Amplificação simultânea de mais de uma sequência de DNA, através da utilização de diversos primers, durante uma única reação de PRC;
Reação de PCR Single Template vs Reacção de PCR Multiple Templates;
Detecção por electroforese capilar.



Aumento da eficiência: diminuição de tempo, custos e esforço;
•Aumento do número de genes que podem ser amplificados de uma vez.


Presença de múltiplos primers pode levar à hibridação entre primers e à adição de um primer errado a um molde;
•Necessidade de tempo extra para separar, por electroforese, os segmentos amplificados.

Aplicações
Identificação de Patogénios;
Análise de Mutações Genéticas;
Análise de Deleção Genética;
Quantificação de Moldes;
Deteção de RNA;
Estudos Forenses.

Real-Time PCR – Sybr® Green 1
Real-Time PCR – Sonda TaqMan®
Bibliografia
Livros:
• Harvey Lodish, Arnold Berk, Chris A. Kaiser and Monty Krieger;Molecular Cell Biology, 7th ed, Freeman and Company, 2008;
• Alberts, Johnson, Walter, Lewis, Raff e Roberts ;Molelular Biology of the Cell 5th ed., Garland Science textbooks , 2008;
• Nussbaum L. Robert, Mclnnes R. Roderick, Willard F. Huntington; Thompson and Thompson Genetics in Medicine; 7th ed, Elsevier, 2007.

Websites:
•http://www.bio-rad.com/en-us/applications-technologies/qpcr-real-time-pcr
• http://strategy.gene-quantification.info/
• http://www.nature.com/leu/journal/v17/n6/fig_tab/2402922f1.html
• http://www.nature.com/nrd/journal/v3/n9/fig_tab/nrd1496_F1.html
• http://www.dnalc.org/resources/animations/pcr.html
• http://siarchives.si.edu/research/videohistory_catalog9577.html


PCR Convencional
Real -Time PCR
PCR-Multiplex
Sonda Taq Man;
Para cada sequência de interesse: 2 primers específicos + 1 sonda Taq Man específica.
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