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Defesa Mestrado

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by

Danielle Barberini

on 5 June 2014

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Transcript of Defesa Mestrado

Índice
Dissertação - Mestrado
Danielle Jaqueta Barberini
Orientador: Prof. Ass. Dr. Rogério Martins Amorim
Botucatu 2013

CARACTERIZAÇÃO IMUNOFENOTÍPICA E POTENCIAL DE DIFERENCIAÇÃO DE CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS PROVENIENTES DE MEDULA ÓSSEA, TECIDO ADIPOSO E CORDÃO UMBILICAL DE EQUINOS
Introdução
- células multipotentes
não hematopoiéticas
habilidade proliferativa
capacidade de diferenciação em linhagens mesenquimais

- 3º maior rebanho de equinos
- 3,2 milhões de empregos
- agronegócio: R$ 7,3 bilhões por ano

Células-tronco mesenquimais (CTMs)
- uso terapêutico

Medula óssea
- mais estudada e utilizada

Tecido adiposo
- grande número de células

Membrana amniótica e cordão umbilical
- coleta, menos imunogênicas

- aderência ao plástico

- diferenciação em múltiplas linhagens mesenquimais

- imunofenotipagem: CD44
CD90
CD29
CD105
CD34
CD45
MHC-I e MHC-II

Terapia autóloga
- sem efeitos deletérios
- limitações: lesões agudas
pacientes idosos


Terapia alogênica
- lesões agudas
- células homogêneas e caracterizadas

Caracterizar imunofenotipicamente

Avaliar o potencial de diferenciação celular

Fontes: medula óssea
tecido adiposo
cordão umbilical

Qual a melhor fonte para um banco de células

terapia alogênica

Objetivos do estudo

10 equinos mestiços
- ambos sexos, 5 a 12 anos, sadios
- medula óssea (n=5)e tecido adiposo n=5)

Amostras de cordão umbilical
- partos (n=2) e matadouro (n=4)
Materiais e Métodos
Medula óssea

Tecido adiposo

Cordão umbilical

Coleta das células-tronco mesenquimais

Medula óssea

Medula óssea
Tecido adiposo

Cordão umbilical

Isolamento das CTMs
Coleta e isolamento das CTMs

Indução da diferenciação celular

Caracterização celular

Tecido adiposo

Medula óssea

Cordão umbilical

Cultivo das CTMs

Repique das células
- tripsina 0,25%
- confluência 80%
- tripsina: 5 minutos a 37ºC
- centrifugações a 340 G por 10 minutos
- formação do "pellet"
3ª passagem
Cultivo das CTMs
Diferenciação condrogênica

Diferenciação osteogênica
adipogênica

Diferenciação celular

Caracterização celular
Citometria de fluxo
Imunocitoquímica
Anticorpos primários

Mouse anti-rat CD90-FITC
Mouse anti-human CD34-FITC
Mouse anti-human CD105-FITC
Mouse anti-horse CD44
Mouse anti-horse MHC-II

Anticorpo secundário goat anti-mouse IgG-FITC
Resultados e Discussão
Cultivo celular

Potencial de diferenciação

Caracterização celular

Aderência ao plástico


CTMs Medula Óssea: 48 horas

CTMs Tecido Adiposo: 32 horas

CTMs Cordão Umbilical: 48 horas
Morfologia fibroblastóide
CTMs Medula óssea: 5 dias

CTMs Tecido adiposo: 3 dias

CTMs Cordão umbilical: 5 dias
Confluência Celular
CTMs-MO
CTMs-CU
CTMs-TA
- Confluência de 80%
- 11 dias
- 7 dias
- 15 dias


CTM-MO 25 dias

CTM-TA 21 dias

CTM-CU 26 dias

3ª Passagem

Média de tempo entre cultivo primário até 3ª passagem
3ª passagem
Diferenciação celular
Caracterização Celular
- osteogênica
- adipogênica
- condrogênica
- Citometria de fluxo

- Imunocitoquímica
Potencial de diferenciação

- Linhagem osteogênica
- Linhagem adipogênica
- Linhagem condrogênica
CTM-MO e CTM-TA: 10 dias
CTM-CU: 15 dias
CTM-MO e CTM-TA: 8 dias
CTM-CU: 15 dias
- 21 dias
CTM-CU

CTM-TA

CTM-MO

Coloração com Alizarin Red : matriz de cálcio

Diferenciação osteogênica

CTM-CU

CTM-TA

CTM-MO

Coloração Oil Red : deposição de gotículas de gordura

Diferenciação adipogênica

Azul de Toluidina

Alcian Blue

CTM-CU

CTM-TA

CTM-MO

Deposição de matriz hialina

Diferenciação condrogênica

Azul de Toluidina
Caracterização Imunofenotípica
Citometria de Fluxo


Imunocitoquímica
Citometria de Fluxo

MHC-II

CTM-CU

CTM-TA

CTM-MO

Imunocitoquímica

Conclusões
Coleta, isolamento e cultivo das CTMs das três fontes mostraram-se eficientes
Multipotência comprovada pelas diferenciações nas linhagens mesodermais
Características imunofenotípicas comprovadas: alta expressão CD44, CD90 e CD105 e baixa ou ausência de expressão CD34 e MHC-II
Terapia alogênica possível: baixa expressão do MHC-II
Referências
Gutierrez-Nibeyro SD: Commercial cell-based therapies for musculoskeletal injuries in horses. Vet Clin North Am Equine Pract 2011, 27:363-371.
Rogers I, Casper RF: Umbilical cord blood stem cells. Best Pract Res Cl Ob 2004, 18:893-908.
Ranera B, Ordovás L, Lyahyai J, Bernal ML, Fernandes F, Remacha AR, Romero A, Vázquez FJ, Osta R, Cons C, Varona L, Zaragoza P, Martín-Burriel I, Rodellar C: Comparative study of equine bone marrow and adipose tissue-derived mesenchymal stromal cells. Equine Vet J 2012, 44:33–42.
Burk J, Ribitsch I, Gittel C, Juelke H, Kasper C, Staszyk C, Brehm W: Growth and differentiation characteristics of equine mesenchymal stromal cells derived from different sources. Vet J 2013, 195:98–106.
Vidal MA, Robinson SO, Lopez MJ, Paulsen DB, Borkhsenious O, Johnson JR, Moore RM, Gimble JM: Comparison of Chondrogenic Potential in Equine Mesenchymal Stromal Cells Derived from Adipose Tissue and Bone Marrow. Vet Surg 2008, 37:713–724.
Hoynowski SM, Fry MM, Gardner BM, Leming MT, Tucker JR, Black L, Sand T, Mitchell KE. Characterization and differentiation of equine umbilical cord-derived matrix cells. Biochem Biophys Res Commun 2007, 362:347–353.
Lovati AB, Corradetti B, Lange-Consiglio A, Recordati C, Bonacina E, Bizzaro D, Cremonesi F: Comparison of equine bone marrow-, umbilical cord matrix and amniotic fluid-derived progenitor cells. Vet Res Commun 2011, 35:103–121.
Corradetti B, Lange-Consiglio A, Barucca M, Cremonesi F, Bizzaro D: Size-sieved subpopulations of mesenchymal stem cells from intervascular and perivascular equine umbilical cord matrix. Cell Prolif 2011, 44:330–342.
Toupadakis CA, Wong A, Genetos DC, Cheung WK, Borjesson DL, Ferraro GL, Galuppo LD, Leach JK, Owens SD, Yellowley CE: Comparison of the osteogenic potential of equine mesenchymal stem cells from bone marrow, adipose tissue, umbilical cord blood, and umbilical cord tissue. Am J Vet Res 2010, 71:1237-1245.
Pascuccia L, Curinab G, Mercatia F, Marinib C, Dall’Aglio C, Paternesi B, Ceccarelli P: Flow cytometric characterization of culture expanded multipotent mesenchymal stromal cells (MSCs) from horse adipose tissue: Towards the definition of minimal stemness criteria. Vet Immunol Immunopathol 2011, 144:499– 506.
Carrade DD, Lame MW, Kent MS, Clark KC, Walker NJ, Borjesson DL: Comparative Analysis of the Immunomodulatory Properties of Equine Adult-Derived Mesenchymal Stem Cells. Cell Med 2012, 4(1):1–11.
Iacono E, Brunori L, Pirrone A, Pagliaro PP, Ricci F, Tazzari PL, Merlo B: Isolation, characterization and differentiation of mesenchymal stem cells from amniotic fluid, umbilical cord blood and Wharton’s jelly in the horse. Reproduction 2012, 143:455–468.
Braun J, Hack A, Weis-Klemm M, Conrad S, Treml S, Kohler K, Walliser U, Skutella T, Aicher WK: Evaluation of the osteogenic and chondrogenic differentiation capacities of equine adipose tissue–derived mesenchymal stem cells. Am J Vet Res 2010, 71:1228-1236.
Ranera B, Lyahyaia J, Romero A, Vázquez FJ, Remacha AR, Bernal ML, Zaragoza P, Rodellar C, Martín-Burriel I: Immunophenotype and gene expression profiles of cell surface markers of mesenchymal stem cells derived from equine bone marrow and adipose tissue. Vet Immunol Immunopathol 2011, 144:147–154.
De Schauwer C, Piepers S, Van de Walle GR, Demeyere K, Hoogewijs MK, Govaere JLJ, Braeckmans K, Soom AV, Meyer E: In Search for Cross-Reactivity to Immunophenotype Equine Mesenchymal Stromal Cells by Multicolor Flow Cytometry. Cytometry Part A 2012, 81A:312-323.
Koerner J, Nesic D, Romero JD, Brehm W, Mainil-Varlet P, Grogan SP: Equine peripheral blood-derived progenitors in comparison to bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells 2006, 24:1613-1619.
Borjesson DL, Peroni JF: The regenerative medicine laboratory: facilitating stem cell therapy for equine disease. Clin Lab Med 2011, 31:109-123.
Colleoni S, Bottani E, Tessaro I, Mari G, Merlo B, Romagnoli N, Spadari A, Galli C, Lazzari G: Isolation, growth and differentiation of equine mesenchymal stem cells: effect of donor, source, amount of tissue and supplementation with basic fibroblast growth factor. Vet Res Commun 2009, 33:811-821.
Mambelli LI, Santos EJC, Frazão PJR, Chaparro MB, Kerkis A, Zoppa ALV, Kerkis I: Characterization of equine adipose tissue-derived progenitor cells before and after cryopreservation. Tissue Eng 2009, 15:87-94.
Kern S, Eichler H, Stoeve J, Kl¨Uter H, Bieback K: Comparative analysisof mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue. Stem Cells 2006, 24:1294-1301.
Brasil
Células-tronco mesenquimais
osteoblastos
adipócitos
condrócitos
tenócitos
miócitos
neurônios
células da glia
hepatócitos
Fontes
Caracterização das CTMs
Terapia com CTMs
Terapia alogênica
Ausência da expressão do MHC-II

- capacidade das CTMs de escapar das células T

- criação de um banco de células
CTMs equinos
Materiais e Métodos
ab
Letras Sobrescritas incomum na mesma coluna diferem (P<0.05)
Índice
Introdução
Objetivos
Materiais e Métodos
Resultados e Discussão
Conclusões

CTMs da Medula Óssea: caracterização imunofenotípica
– melhor fonte de obtenção de CTMs

CTM-MO e CTM-TA
- diferenciação osteogênica: 7 a 18 dias
- diferenciação adipogênica: 7 a 15 dias
(Ranera et al., 2012; Burk et al., 2013; Vidal et al., 2008)

CTM-CU
- diferenciação osteogênica: *14 a 21 dias
(Hoynowski et al., 2007; Lovati et al., 2011)
*10 dias
(Corradetti et al., 2011)

- diferenciação adipogênica: 25 dias
(Lovati et al., 2011)

CTM-MO
- melhor diferenciação osteogênica
(Lovati et al., 2011; Burk et al., 2013)
- melhor diferenciação condrogênica
(Toupadakis et al., 2010; Vidal et al., 2008)

CTM-CU
- melhor diferenciação condrogênica
(Lovati et al., 2011; Burk et al., 2013)
- diferenciação em células neuronais
(Hoynowski et al., 2007)
Alta marcação para CD44, CD90 e CD105
(Pascuccia et al., 2011; Carrade et al., 2012; Iacono et al., 2012; Braun et al., 2010)

CD105 variação entre amostras SCU
(De Schauwer et al., 2012)

CD34 maior marcação em CTM-TA
(Ranera et al., 2011; Ranera et al., 2012)

MHC-II negativo
(Carrade et al., 2012; Hoynwski et al., 2007; Corradeti et al., 2011)

MHC-II baixa expressão
(De Schauwer et al., 2012)
Melhor Fonte
- Medula óssea: melhor diferenciação, mais células progenitoras mesenquimais
(Koerner et al., 2006; Rogers e Casper 2004)

- Tecido adiposo: maior número de células, maior proliferação, mesmo após criopreservação
(Borjesson e Peroni 2011; Burk et al., 2013; Colleoni et al., 2009; Mambelli et al., 2009)

- Sangue do cordão umbilical: menos imunogênicas, coleta, maior proliferação
(Rogers e Casper, 2004; Kern et al., 2006)
OBRIGADA PELA ATENÇÃO !!!
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