Loading presentation...

Present Remotely

Send the link below via email or IM

Copy

Present to your audience

Start remote presentation

  • Invited audience members will follow you as you navigate and present
  • People invited to a presentation do not need a Prezi account
  • This link expires 10 minutes after you close the presentation
  • A maximum of 30 users can follow your presentation
  • Learn more about this feature in our knowledge base article

Do you really want to delete this prezi?

Neither you, nor the coeditors you shared it with will be able to recover it again.

DeleteCancel

Make your likes visible on Facebook?

Connect your Facebook account to Prezi and let your likes appear on your timeline.
You can change this under Settings & Account at any time.

No, thanks

Prezentacja z biotechnologii w medycynie molekularnej

No description
by

Klaudia Rumak

on 11 March 2015

Comments (0)

Please log in to add your comment.

Report abuse

Transcript of Prezentacja z biotechnologii w medycynie molekularnej

Prezentacja z biotechnologii w medycynie molekularnej
Planowaie produkcji białek rekombinowanych
Planując produkcję heterologicznego białka należy dokładnie przeanalizować każdy jej etap!

Najistotniejszy jest wybór gospodarza oraz odpowiednich narzędzi molekularnych!

Z dostępnych na rynku rekombinowanych biofarmaceutyków około 39% zostało wyprodukowanych na bazie: E. coli, 15% drożdży i 35% linii CHO.
Problem nadprodukcji
Nadmiar
wektorów plazmidowych
niesie za sobą ryzyko destabilizacji całego systemu. Niektóre komórki tracą pobrane plazmidy i w efekcie rosną szybciej niż te, które utrzymują dodatkowe geny.

System może być także niestabilne ze względu na aktywność enzymów proteolitycznych gospodarza.

Produkty docelowe chroni się przed degradacją zmieniając sekwencję nukleotydową wektora. Do
N-końca kodowanego polipeptydu dodaje się jeden lub kilka aminokwasów, których sekwencja może być później wykorzystana również do identyfikacji transkryptów.

Otrzymywanie białek rekombinowanych
Lis Martyna
Rumak Klaudia
Krótkie przypomnienie
Białka rekombinowane
- białka wytwarzane przez bakterie, drożdże oraz zwierzęce i roślinne linie komórkowe w wyniku ekspresji obcego genu wprowadzonego metodami inżynierii genetycznej.
Wektor ekspresyjny
Musi nieść:
*
gen reporterowy - umożliwia selekcję komórek, które przyjęły konstrukt z genem obcego białka.

Może być zaopatrzony w :
*
sekwencje regulujące stabilność syntetyzowanych peptydów i warunkujące jego wydzielanie poza komórkę gospodarza.
W celu wydzielenia właściwego białka poza komórkę niezbędny jest fragment DNA kodujący peptyd sygnalny, który pozwala na transport białka przez błonę komórkową, do pożywki hodowlanej.
Optymalizacja procesu biosyntezy
Warunki prowawadzenia hodowli częściowo wpływają na sposób pozyskiwania białka, jego czystość i wydajność.

Bardzo ważnym elementem jest optymalizacja parametrów hodowli m.in. wybór bioreaktora, skład podłoża, gęstość inokulum, kontrola pH, temperatury i natlenienia i itp.

Peptydy stanowią największa grupą związków organicznych.

Funkcje:
*
wchodzą w skład struktur komórkowych i płynów ustrojowych
*
transportują i magazynują substancje
*
warunkują odpowiedź immunologiczną organizmu
*
regulują procesy metaboliczne
*
regulują procesy krzepnięcia krwi.
Białka górą! :)
Rys. 1 Struktura insuliny
Rys. 2 Plazmidowy wektor ekspresyjny
Bakteryjne sysytemy ekspresyjne
Pierwsze próby pozyskiwania białek rekombinowanych oparte były na bakteryjnych systemach ekspresyjnych.

Zalety:
• Dobrze poznana biologia na poziomie molekularnym;
• Łatwa manipulacja genetyczna
• Łatwość posługiwania się nimi i otrzymywania białek rekombinowanych
• Opracowana technologia fermentacyjna
• Szybkie namnażanie na prostych i tanich podłożach
• Gromadzenie się wytworzonego białka wewnątrz komórki

Wady:
• Skomplikowana obróbka materiału;
• Brak możliwości pozyskania niektórych typów cząsteczek
• Obecność endotoksyn
• Obecność w białkach trudnych w ekspresji wiązań disulfidowych

Rys. 3 E. coli
Bakteryjne sysytemy
ekspresyjne
Alternatywą jest stosowanie innych gatunków mikroorganizmów, np. gram-dodatnich bakterii Bacillus. Nie wytwarzają one lipopolisacharydu oraz posiadają zdolność wydzielania dużych ilości białek do podłoża.
Innym przykładem bakterii stosowanych do produkcji białek rekombinowanych są Lactococcus lactis, które stosuje się np. podczas otrzymywania peptydów błonowych.
Słabe strony systemu bakteryjnego
• Żadne organizmy prokariotyczne nie wycinają niekodujących fragmentów DNA.
• Białka o masie cząsteczkowej większej niż 30 kDa mogą ulegać nieprawidłowemu fałdowaniu w komórkach bakteryjnych.
• W niektórych przypadkach produkty wprowadzonych genów są uznawane za obce.
• Bakterie nie są zdolne do przeprowadzania mechanizmów modyfikacji posttranslacyjnej.
• Produkty wytwarzane w systemach bakteryjnych mogą być niestabilne lub nieaktywne biologicznie
.

Eukariotyczne systemy ekspresyjne
Aby rozwiązać problem braku obróbki posttranslacyjnej opracowano systemy ekspresyjne opierające się na komórkach eukariotycznych.

Uzyskiwane dzięki nim białka w większym stopniu przypominają formy natywne i mogą być wprowadzane do organizmu człowieka, a zatem służyć jako leki.

W ten sposób otrzymuje się np. hormon wzrostu, β-interferon, białko krzepliwości krwi (czynnik VIII i IX), fibrynogen, erytropoetynę.

Ssacze wektory
Rys. 4 Struktura hormonu
wzrostu
Wektory wahadłowe - inaczej bifunkcjonalnymi lub czółenkowymi.
Mają one dodatkową sekwencję charakterystyczną dla komórek prokariotycznych i dzięki temu mogą być namnażane w bakteriach. Dopiero potem DNA wprowadza się do komórek eukariotycznego gospodarza za pomoca elektroporacji.

Rys. 5 Wektor wahadłowy używany w E. coli i drożdżach
Rys. 6 Saccharomyces cerevisiae
Eukariotyczne systemy ekspresyjne
• Drożdże Saccharomyces cerevisiae - ich genetyka i fizjologia są dobrze poznane. Hodowla nie jest trudna, a wytworzone białka można łatwo oczyszczać za pomocą sekrecji.

• Komórkami owadzimi - wykorzystuje się do hodowli bakulowirusów. Tak zwany system bakulowirusowy, jest bardzo efektywny pod względem sekrecji białek do podłoża. Kolejną jego zaletą jest to, że uzyskiwane w nim białka mają wzór glikozylacji zbliżony do wzoru swoich ssaczych odpowiedników.
Komórki owadzie służą między innymi do produkcji antywirusowego białka – β-interferonu oraz erytropoetyny.

WADY I ZALETY
+ Wolniejsze tempo translacji i fałdowania - są one lepszymi gospodarzami w przypadku produkcji białek błonowych.
- Stosunkowo niska wydajność idąca w parze z wysokimi kosztami całego procesu.

Obecnie produkcja białek rekombinowanych jest możliwa również z wykorzystaniem całych genetycznie zmodyfikowanych organizmów. Dzięki zastosowaniu metod inżynierii genetycznej zdołano skonstruować między innymi owce i kozy wydzielające do mleka odpowiedniki ludzkich białek. Doustne podawanie leku jest dogodne również z punktu widzenia pacjenta. W ten sposób produkuje się m.in. czynnik IX i białko osocza
α1-antytrypsynę.
Produkcja białek w roślinach
Produkcję białek rekombinowanych z użyciem roślin określa się mianem rolnictwa molekularnego. Najczęściej stosowanymi gatunkami są kukurydza, tytoń, ziemniaki i pomidory.

Rośliny to organizmy dobrze poznane zarówno pod względem genomu jak i najlepszych technik uprawy. Lista wytwarzanych w ten sposób białek obejmuje między innymi przeciwciała i ich fragmenty, antygeny do produkcji szczepionek, enzymy i cytokiny.

Hodowla roślin jest bardzo wydajna i może być prowadzona na polu oraz w zamkniętych szklarniach. Zastosowanie tego typu biofabryk mogłoby znacznie obniżyć koszty produkcji białek i w ten sposób wpłynąć na cenę i dostępność niektórych biofarmaceutyków.

Białka rekombinowane w medycynie
Zastosowanie białek rekombinowanych zwiększa wydajność produkcji leków i ich dostępność.
Niweluje problem niezgodności i ogranicza do minimum zagrożenie związane z przenoszeniem czynników chorobotwórczych.

Białka rekombinowane w przemyśle
Przykładowe białka rekombinowane stosowane w przemyśle (według Winter P.C.):

• Renina, lipaza – serowarstwo;
• α-amylaza – przemysł browarniczy;
• Katalaza – antyoksydant żywnościowy;
• Celulaza – produkcja alkoholu i glukozy;
• Proteaza – detergenty;
• Bromelaina – zmiękczanie mięsa, klarowanie soków;

Rys. 7 Struktura Katalazy

Literatura



1. Bishop J., 2001: Ssaki transgeniczne. Wydawnictwo Naukowe PWN. Warszawa 2001.
2. Canadian Institute for Environmental Law and Policy: Plant Molecular Farming (PMF), 2006.
3. Ratledge C., Kristiansen B.: Podstawy biotechnologii. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszwa 2011.
4. Sirko A., Vaněk T., Góra-Sochacka A., Redkiewicz P.: Recombinant Cytokines from Plants. Int. J. Mol. Sci. 12: 3536-3552, 2011.
5. Spök A., Karner S.: Plant Molecular Farming Opportunities and Challenges. JRC European Comission, 2008.
6. Stryer L.: Biochemia. Wydawnictwo Naukowe PWN. Warszawa 2003.
7. Turner P.C., McLennan A.G., Bates A.D., White M.R.H.: Krótkie wykłady. Biologia molekularna. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2007.
8. Staroń A., Grabowska A., Jagusztyn-Krynicka E. K.: Nadprodukcja i oczyszczanie rekombinowanych, heterologicznych białek w komórkach Escherichia coli. Warszawa 2008.
9. Winter P.C., Hickey G.I., Fletcher H.L.: Krótkie wykłady. Genetyka. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2004.
10. http://www.molecularfarming.com/
11. Robak M., Walczak E.: Niekonwencjonalne drożdże w produkcji heterologicznych białek, Katedra Biotechnologii i Mikrobiologii Żywności, Wydział Nauk o Żywności, Uniwersytet Przyrodniczy, Wrocław

DZIĘKUJEMY
ZA UWAGĘ
Full transcript