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Tecnologia do DNA Recombinante e Pesquisa de Informações em

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by

Pedro Silva

on 23 May 2014

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Transcript of Tecnologia do DNA Recombinante e Pesquisa de Informações em

Módulo 1 (CBM22-1): 33-180 (148 a.a.)
Módulo 2 (GH10): 195-538 (344 a.a.)
Purificação do DNA
Objetivo
: isolar o DNA plasmídico
Perfil de restrição do DNA plasmídico isolado
Objetivo
: Determinar o grau de pureza e concentração das amostras do DNA plasmídico isolado
Produção e transformação de um plasmídeo recombinante em
E.coli
Objetivo
: criar um plasmídeo pBluescript recombinante com o gene
xynV
Separação dos fragmentos de DNA por eletroforese
Objetivo
: separação de fragmentos de DNA por eletroforese para construir um mapa de restrição do plasmídeo pBluescript SK-
Detecção de animais transgénicos por PCR
Objetivo
: detecção de murganhos transgénicos, de entre 12 amostras, por PCR e com recurso à eletroforese em gel de agarose
Tecnologia de DNA Recombinante e Pesquisa de Informações em Bases de Dados Biológicas

Resultados
--> gene incorporado no DNA plasmídico --> maior peso molecular
Daniela Silva 2013098
Pedro Silva 2013094
Rute Abreu 2013072
Sandra Rebelo 2013083
Tiago Cordeiro 2013112

Introdução
cadeia dupla de DNA
independente
O que é um plasmídeo?
pBluescript SK-
gene de resistência à ampicilina
+
gene da B-galactosidase
gene
xynV
clivagem
Formação de um plasmídeo recombinante
Transformação em
E.coli

Purificação do DNA
Separação dos fragmentos de DNA do plasmídeo por eletroforese
Construção de um mapa de restrição
Detecção do gene de interesse em murganhos transgénicos por PCR
Pesquisa de informações relativas a uma proteína
degrada o X-Gal
BRANCO
AZUL
3 etapas:

ligação

transformação
em
E.coli
XL10 - choques térmicos e cloreto de cálcio

quantificação
de colónias em meio de cultura com ampicilina e X-Gal
Ligação
de
Clostridium thermocellum
vetor pBluescript SK-
gene da B-galactosidase
gene de resistência à ampicilina
gene
xynV
gene de resistência à ampicilina
gene da B-galactosidase
Resultados
gene da B-galactosidase
inativo
gene da B-galactosidase
ativo
Esperado
: colónias brancas
Observado
: colónias azuis
Erro de pipetagem
Tempo insuficiente (10 min)
Esperado
: colónias azuis
Observado
: nenhum desenvolvimento bacteriano
Erro na manipulação dos instrumentos
Erro de pipetagem
Esperado
: colónias azuis
Observado
: colónias brancas
- Controlo
positivo
para o vetor utilizado
Esperado
: nenhum desenvolvimento bacteriano
Observado
: nenhm desenvolvimento bacteriano
- Controlo
negativo
para o veto utilizado
Eficiência das células competentes: 1,76 x 10
7
- referência --> 10 - 10
7
9
Contaminação do meio
Mutação do gene da galact.
3 etapas:

Seleção
de uma colónia branca

Centrifugações
--> separar as bactérias do meio de cultura
--> separar o DNA (sobrenadante) das proteínas

Purificação
- isolamento do DNA plasmídico do cromossómico
--> coluna de centrifugação acoplada a um tubo de
recolha

Eletroforese
em gel de agarose
não migra
--> quantidade: mais brilhante --> maior quantidade
--> Espectrofotometria
2 leituras nos comps. de ondas:
- 260 nm: ácidos nucleicos --> determinar a concentração
- 280 nm: proteínas --> determinar o grau de contaminação
Fotometria
--> poucos comps. de onda na zona do visível
Resultados
DO = 0.464

DO = 0.113
260
280
Rácio
= 4.11
- referência: rácio > 1,8 --> amostra pura
-->
Eletroforese
- fatores de influência:
carga elétrica --> grupo fosfato dos ácidos nucleicos
confere carga negativa
massa molecular --> fragmentos maiores (+ pares de
de bases) migram com menor velocidade - menor distância
estrutura --> 3 diferentes:
- circular relaxada
- linear
- sobre-enrolada
Resultados
Mapa de Restrição
- PCR --> Reação de Polimeralização em Cadeia

nº cópias = (nº de fragm.)
nº ciclos
- Componentes:
DNA molde
primers
DNA polimerase --> Taq polimerase
Nucleótidos dNTP
Cofator --> MgCl
Termociclador
- Mecanismo PCR:
separação da dupla hélice de DNA
(fase de desnaturação)
ligação dos primers à sequência
complementar de interesse
fase de alongamento em que a Taq atua
Resultados
Animais transgénicos --> têm o gene
xynV
(500 bp)
Pesquisa de informações em bases de dados biológicas
Permite detectar
falsos negativos
por comparação com o marcador
500 bp
Dois módulos N-Terminais (CBM22-1 e GH10) da xilanase Y de
Clostridium thermocellum
GTTCTGCTTA GCGGAAGAAC GGCTTACAAA GGTTCAGAAT CACTCTTGGT AAGGAACCGT ACGGCAGCAT GGAACGGAGC ACAACGGGCG CTGAATCCCA GAACGTTTGT TCCCGGAAAC ACATATTGTT TCAGCGTAGT GGCATCGTTT ATTGAAGGTG CGTCTTCCAC AACATTCTGC ATGAAGCTGC AATACGTAGA CGGAAGCGGC ACTCAACGGT ATGATACCAT AGATATGAAA ACTGTGGGTC CAAATCAGTG GGTTCACCTG TACAATCCGC AATACAGAAT TCCTTCCGAT GCAACAGATA TGTATGTTTA TGTGGAAACA GCGGATGACA CCATTAACTT CTACATAGAT GAGGCAATCG GAGCGGTTGC CGGAACTGTA ATCGAAGGAC CTGCTCCACA GCCTACACAG CCTCCGGTAC TGCTTGGCGA TGTAAACGGT GATGGAACCA TTAACTCAAC TGACTTGACA ATGTTAAAGA GAAGCGTGTT GAGGGCAATC ACCCTTACCG ACGATGCAAA GGCTAGAGCA GACGTTGACA AGAATGGATC GATAAACAGC ACTGATGTTT TACTTCTTTC ACGCTACCTT TTAAGAGTAA TCGACAAATT TCCTGTAGCA GAAAATCCTT CTTCTTCTTT TAAATATGAG TCGGCCGTGC AATATCGGCC GGCTCCTGAT TCTTATTTAA ACCCTTGTCC GCAGGCGGGA AGAATTGTCA AGGAAACATA TACAGGAATA AACGGAACTA AGAGTCTTAA TGTATATCTT CCATACGGTT ATGATCCGAA
TTTAATTTAT AAATTAAATT AAAAATTAAA ATTTAAAAGG AGGTTGCTTA TGAAAAACAA GAGAGTTTTG GCAAAAATAA CGGCTCTTGT GGTATTGCTG GGAGTGTTTT TTGTATTACC GTCAAACATA AGTCAGCTAT ATGCTGATTA TGAAGTGGTT CATGACACTT TTGAAGTTAA CTTTGACGGA TGGTGTAACT TGGGAGTCGA CACATATTTA ACGGCAGTTG AAAATGAAGG AAACAACGGT ACAAGAGGTA TGATGGTAAT AAATCGCTCC AGTGCGAGTG ACGGTGCGTA TTCGGAAAAA GGTTTCTATC TCGACGGTGG TGTAGAATAC AAGTACAGTG TTTTTGTAAA ACACAACGGG ACCGGCACCG AAACTTTCAA ACTTTCTGTG TCCTATTTGG ATTCGGAAAC AGAAGAAGAA AATAAGGAAG TAATTGCAAC AAAGGATGTT GTGGCCGGAG AATGGACTGA GATTTCGGCA AAATACAAAG CACCCAAAAC TGCAGTGAAT ATTACTTTGT CAATTACAAC CGACAGCACT GTAGATTTCA TTTTTGACGA TGTAACCATA ACCCGTAAAG GAATGGCTGA GGCAAACACA GTATATGCAG CAAACGCTGT GCTGAAAGAT ATGTATGCAA ACTATTTCAG AGTTGGTTCG GTACTTAACT CCGGAACGGT AAACAATTCA TCAATAAAGG CCTTGATTTT AAGAGAGTTT AACAGTATTA CCTGTGAAAA TGAAATGAAG CCTGATGCCA CACTGGTTCA ATCAGGATCA ACCAATACAA ATATCAGGGT TTCTCTTAAT CGTGCAGCAA GTATTTTAAA
TAAGAAACTT TAAAACACCC TTTATAAAAA TACAAAGAAT TACAGGCAAT TATAGTGTAA TGTGGATTTT AACTAAAATG GAAGGAGGAA TGTAATTCGT AATAGATATT ATGATATAAT TTGTTTAGAG CATGCTTAAG TTTATTTAAA
CTTCTGTGCA CAAAATAATA TAGCCGTCAG AGGTCATACA CTGGTTTGGC ACAGCCAGAC ACCTCAATGG TTTTTCAAAG ACAATTTCCA GGACAACGGA AACTGGGTTT CCCAATCAGT TATGGACCAG CGTTTGGAAA GCTACATAAA AAATATGTTT GCTGAAATCC AAAGACAGTA TCCGTCTTTG AATCTTTATG CCTATGACGT TGTAAATGAG GCAGTAAGTG ATGATGCAAA CAGGACCAGA TATTATGGCG GGGCGAGGGA ACCTGGATAC GGAAATGGTA GATCTCCATG GGTTCAGATC TACGGAGACA ACAAATTTAT TGAGAAAGCA TTTACATATG CAAGAAAATA TGCTCCGGCA AATTGTAAGC TTTACTACAA CGATTACAAC GAATATTGGG ATCATAAGAG
AGACTGTATT GCCTCAATTT GTGCAAACTT GTACAACAAG GGCTTGCTTG ACGGTGTGGG AATGCAGTCC CATATTAATG CGGATATGAA TGGATTCTCA GGTATACAAA ATTATAAAGC AGCTTTGCAG AAATATATAA ATATCGGTTG TGATGTCCAA ATTACCGAGC TTGATATTAG TACAGAAAAC GGCAAATTTA GCTTACAGCA 1621 GCAGGCTGAT AAATATAAAG CTGTTTTCCA GGCAGCTGTT GATATAAACA GAACCTCCAG CAAAGGAAAG GTTACGGCTG TCTGTGTATG GGGACCTAAT GACGCCAATA CTTGGCTCGG TTCACAAAAT GCACCTCTTT TGTTTAACGC AAACAATCAA CCGAAACCGG CATACAATGC GGTTGCATCC ATTATTCCTC AGTCCGAATG GGGCGACGGT AACAATCCGG CCGGCGGCGG AGGAGGAGGC AAACCGGAAG AGCCGGATGC AAACGGATAT TATTATCATG ACACTTTTGA AGGAAGCGTA GGACAGTGGA CAGCCAGAGG ACCTGCGGAA
Sequência de nucleótidos
CAAAAAATAT AACATTTTCT ACCTTATGCA TGGCGGCGGT GAAAATGAGA ATACGATTTT CAGCAACGAT GTTAAATTGC AAAATATCCT TGACCACGCG ATTATGAACG GTGAACTTGA GCCTTTGATT GTAGTAACAC CCACTTTCAA CGGCGGAAAC TGCACGGCCC AAAACTTTTA TCAGGAATTC AGGCAAAATG TCATTCCTTT TGTGGAAAGC AAGTACTCTA CTTATGCAGA ATCAACAACC CCACAGGGAA TAGCCGCTTC AAGAATGCAC AGAGGTTTCG GCGGATTCTC AATGGGAGGA TTGACAACAT GGTATGTAAT GGTTAACTGC CTTGATTACG TTGCATATTT TATGCCTTTA AGCGGTGACT ACTGGTATGG AAACAGTCCG CAGGATAAGG CTAATTCAAT TGCTGAAGCA ATTAACAGAT CCGGACTTTC AAAGAGGGAG TATTTCGTAT TTGCGGCCAC CGGTTCCGAC CATATTGCAT ATGCTAATAT GAATCCTCAA ATTGAAGCTA TGAAGGCTTT GCCGCATTTT GATTATACTT CGGATTTTTC CAAAGGTAAT TTTTACTTTC TTGTAGCTCC GGGCGCCACT CACTGGTGGG GATACGTAAG ACATTATATT TATGATGCAC TTCCATATTT CTTCCATGAA TGAATGAGAA AGAAAAACAT GATTGAGTTT GTAATCAATA AAAAAAGGAA TTTTTTAGTG GTGTCCAGGT TATTGAA
3027 bp
Sequência de aminoácidos
MKNKRVLAKI TALVVLLGVF FVLPSNISQL YADYEVVHDT FEVNFDGWCN LGVDTYLTAV ENEGNNGTRG MMVINRSSAS DGAYSEKGFY LDGGVEYKYS VFVKHNGTGT ETFKLSVSYL
DSETEEENKE VIATKDVVAG EWTEISAKYK APKTAVNITL SITTDSTVDF IFDDVTITRK GMAEANTVYA ANAVLKDMYA NYFRVGSVLN SGTVNNSSIK ALILREFNSI TCENEMKPDA TLVQSGSTNT NIRVSLNRAA SILNFCAQNN IAVRGHTLVW HSQTPQWFFK DNFQDNGNWV SQSVMDQRLE SYIKNMFAEI QRQYPSLNLY
AYDVVNEAVS DDANRTRYYG GAREPGYGNG RSPWVQIYGD NKFIEKAFTY ARKYAPANCK LYYNDYNEYW DHKRDCIASI CANLYNKGLL DGVGMQSHIN ADMNGFSGIQ NYKAALQKYI NIGCDVQITE LDISTENGKF SLQQQADKYK AVFQAAVDIN RTSSKGKVTA VCVWGPNDAN TWLGSQNAPL LFNANNQPKP AYNAVASIIP QSEWGDGNNP AGGGGGGKPE EPDANGYYYH DTFEGSVGQW TARGPAEVLL SGRTAYKGSE SLLVRNRTAA WNGAQRALNP RTFVPGNTYC FSVVASFIEG ASSTTFCMKL
QYVDGSGTQR YDTIDMKTVG PNQWVHLYNP QYRIPSDATD MYVYVETADD TINFYIDEAI GAVAGTVIEG PAPQPTQPPV LLGDVNGDGT INSTDLTMLK RSVLRAITLT DDAKARADVD KNGSINSTDV LLLSRYLLRV IDKFPVAENP SSSFKYESAV QYRPAPDSYL NPCPQAGRIV KETYTGINGT KSLNVYLPYG YDPNKKYNIF YLMHGGGENE NTIFSNDVKL QNILDHAIMN GELEPLIVVT PTFNGGNCTA QNFYQEFRQN
VIPFVESKYS TYAESTTPQG IAASRMHRGF GGFSMGGLTT WYVMVNCLDY VAYFMPLSGD YWYGNSPQDK ANSIAEAINR SGLSKREYFV FAATGSDHIA YANMNPQIEA MKALPHFDYT SDFSKGNFYF LVAPGATHWW GYVRHYIYDA LPYFFHE
Atividade Catalítica
Endo-1,4-beta-xilanase Y
3.2.1.8
-
Glicosídeo hidrolase
:
--> Hidrolase
--> Glicosilase
--> Glicosidase
Mecanismo: endohidrólise de ligações beta-D-xilosídicas (da 1 à 4) em xilanos -->
degradação de celulose e hemicelulose
Bibliografia
-->
PRATES, José A. Mestre et all. Sumários e Protocolos Técnicos das Aulas da Disciplina de Biologia Molecular da Célula. (2006). Edição 2013.
-->
GenBank Database: www.ncbi.nlm.nih.gov
-->
Uniprot: www.uniprot.org
-->
Protein Data Bank: www.rcsb.org
-->
PCR. Acedido em: 10 de Maio de 2014, em:
http://www.icb.ufmg.br/mor/pad-morf/pcr2.htm .
-->
Learn Genetics; PCR. Acedido em: 11 de Maio de 2014, em:
http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/pcr/ .
-->
DNA Learning Center; Polymerase Chain Reaction. Acedido em 11 de Maio de 2014, em: http://www.dnalc.org/resources/animations/pcr.html
1
0.464
50 microgramas/mL
x
x
= 23.2 microgramas/mL
fator de diluição =5
116 microgramas/mL
Full transcript