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Clonación acelular: Reacción en cadena de la polimerasa (PCR

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Marvin Solis

on 28 June 2016

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Transcript of Clonación acelular: Reacción en cadena de la polimerasa (PCR

PCR (Reacción en Cadena de la polimerasa o Polymerase Chain Reaction)
Su objetivo es la amplificación directa de un gen o un fragmento de DNA, o indirecta de un RNA.

Amplificación propiamente dicha: Para disponer de cantidad suficiente como para utilizarlo con fines diversos.
Detección: Para poder detectar en muestras con pequeñas cantidades del DNA diana.

La PCR es una metodología resultante de la aplicación práctica de tres conceptos:
Globalmente interesa describir la clonación desde el punto de vista de su finalidad es decir:
Clonación de organismos:
plantas u animales completos
Clonación de células:
aisladas o formando tejidos u órganos
Clonación de moléculas:
sean estas genes o fragmentos de DNA o RNA, esta clonación de puede dividir en dos tipos:

Para la realización práctica se precisan en la mezcla de reacciones los sig reactivos:
Los cuatro dNTPs (desoxirribonucleósidos-trifosfato) para la síntesis de las innumerables copias de DNA, para ser reconocidas por la pol deben de ir acompañados del ion magnesio.
Dos oligonucleótidos de cadena sencilla, sus secuencias han de ser complementarias a los dos extremos 3' de la región diana, uno en cada hebra de modo que puedan ejercer como cebadores para la replicación.
Una DNA pol termoestable, la mas empleada se llama pol Taq.

Automatización de la PCR
Es un método sencillo y de bajo costo, con empleo de componentes estables al calor y desarrollo de termocicladores para programar cambios de temperatura.
Mediante la automatización se hace factible la realización de un numero elevado de ciclos y aumenta la precisión del proceso.
"Clonación acelular: Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)"

MARVIN SOLIS
Grupo: 2

Ejemplos de las aplicaciones de la PCR:
Detección de secuencias sin purificación previa
Secuencias de ac. nucleicos
Establecimiento de polimorfismos de secuencia
Rastreo de mutaciones
Diagnósticos de enfermedades genéticas
Resolución de problemas forenses o arqueológicos
Estudios evolutivos
Determinación de microorganismos infecciosos
Introducción general a la clonación
Clonación consiste en la obtención de un clon, entendido como un conjunto de elementos genéticamente idénticos entre si y a su precursor, pueden ser moléculas, células, tejidos, órganos u organismos pluricelulares completos.
1.- Clonación Acelular:
clonación de moléculas sin intervención de célula alguna (amplificación in vitro de moléculas de DNA o RNA mediante la reacción en cadena de la DNA pol) (PCR)

Clonación Celular:
Amplificación de moléculas de ac. nucleico mediante su introducción, asistida por vectores en células anfitrionas en cultivo. (Emplea la tecnología de DNA recombinante)

1.-Desnaturalización del DNA
para dar hebras sencillas.
Calentamiento para la separación de las dos hebras de DNA mediante una incubación breve entre 68 y 97º C

2.-Hibridación
especifica de la hebra sencilla con un oligonucleótido. También se denomina etapa de templado. (Disminución de temperatura que permite la reasociación de hebras sencillas tras la desnaturalización termina)

3.-Replicación
de la hebra sencilla por un DNA pol a partir de oligonucleótido anterior como cebador: también, elongación o extensión del cebador o polimerización.

La duración total es de alrededor de 2 hrs, dependiendo de las condiciones experimentales concretas.

Variantes del método
Han surgido modificaciones derivadas del método básico inicial con el propósito de mejorar el rendimiento o la especificidad, amplificar moléculas de RNA en lugar de DNA, producir cadenas de cadena sencilla.
1.- PCR con “comienzo en caliente” (hot start PCR)
Consiste en comenzar la reacción cuando la temperatura de la mezcla es suficientemente alta, de tal forma que no se produzcan hibridaciones inespecíficas.
Evitan la elongación de cebadores que hayan podido asociarse al comienzo y se aumenta de manera señalada la especificidad de la amplificación.

2.- PCR “larga” (long start)
Técnica que permite la amplificación de toda la molécula de mtDNA.
Objetivos:
Superar los limites de la PCR convencional.
Amplificar las regiones dianas de gran tamaño (5 y 40 kb).
Utiliza mezclas de ADN polimerasa Taq, carece de actividad correctora pero es muy eficaz en la elongación y Ptu, posee la actividad correctora que evita la introducción de errores en la elongación de las cadenas.

Bibliografía
Luque, José. Herráez, Ángel. Biología Molecular e Ingeniería Genética. Ed. Harcourt. 2001. Madrid, España. Págs. 187-195
http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/capacitybuilding/manuals/Manual%20ES/Sesi%C3%B3n6.pdf
http://es.wikipedia.org/wiki/Reacci%C3%B3n_en_cadena_de_la_polimerasa

3.- PCR “anidada”
Es una variante de la PCR convencional que comprende  dos rondas de amplificación con distintos pares de cebadores en cada una, con el fin de incrementar la sensibilidad y la especificidad de la detección. 
1.- Reacción con los cebadores externos para amplificar una región de ADN mas extensa, que contiene el segmento diana.
2.- Producto de amplificación anterior se utiliza como molde de una segunda PCR con los cebadores internos para amplificar la región específica.
4.- PCR inversa
Consiste en clonar regiones desconocidas de un DNA, situadas en secuencias diana conocida, para ello es cortar el DNA en los lados de la región diana con una enzima de restricción, de tal formar que los extremos cohesivos resultantes pueden hibridar entre si, formando una molécula circular que se cierra con una ligasa y se realiza la PCR con cebadores que hibridan con los extremos 5´ de la secuencia conocida.

5.- PCR con adaptadores
Pueden amplificarse una región de DNA de secuencia desconocida al unir los fragmentos obtenidos al digerir el DNA con una enzima de restricción, unos adaptadores (oligonucleotidos sintéticos) y utilizar los cebadores correspondientes a dichas secuencias.
Se añaden cebadores específicos en las secuencias 3´ de los adaptadores, y se amplifica el conjunto de adaptadores y secuencia diana, pero debe señalarse que se amplifican por igual todos los fragmentos y no uno solo.

6.- PCR asimétrica
Produce fragmentos de ADN de cadena simple al utilizar dos cebadores de diferentes concentraciones molares (50/1 y 100/1), de modo que tras los primeros ciclos de PCR uno de ellos se agota y solo una de sus hebras sigue amplificándose gracias al cebador mas abundante.

El producto de PCR contiene 10 – 20 veces mas ADN monocatenario que de ADN bicatenario.

7.- RT-PCR: amplificación de RNA (reverse transcriptase)
Amplificación de RNA , y en particular de ARNm, a través de la síntesis de su DNA complementario (cDNA) que después de amplifica por PCR o sea, se obtienen copias del DNA.
Método muy utilizado para medir expresión génica in Vitro y en análisis cualitativo de virus, y es una técnica de laboratorio comúnmente usada en Biología Molecular para generar una gran cantidad de copias de ADN.

Gracias por su atención
Ejemplos de las aplicaciones de la PCR:
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