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Detecção Molecular de Helicobacter pylori em águas tratadas

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by

Isabella Rosa

on 22 January 2014

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Transcript of Detecção Molecular de Helicobacter pylori em águas tratadas

Detecção Molecular
Detecção Molecular de
Helicobacter pylori
em águas tratadas e relação com Morbidade Hospitalar por Gastrite, Úlcera e Câncer Gástrico

Isabella Inês Rodrigues Rosa
Orientador: Prof. Dr. Carlos Eduardo Anunciação
Introdução
Objetivos
Metodologia
Resultados
Discussão
Conclusões
1875 - Bactérias envolvidas com gastrite.

Evidenciações de bactérias espiraladas em mucosas gástricas.

1982 - Obtenção da primeira cultura por Barry J. Marshall e J. Robin Warren.
Breve Histórico
Microscopia eletrônica evidenciando a presença de microrganismo espiralado até então desconhecido, em mucosa gástrica de gatos. (Fonte: The Campylobacter History, Marshall, 2001).
Breve Histórico
Ingestão de microorganismos por Marshall provocou sintomas graves.

1989 - Classificação como
Helicobacter plori.

2005 - Marshall e Warren recebem o prêmio Nobel de Medicina e Fisiologia.
Impregnação por prata em biópsia gástrica evidenciando a presença de H. pylori em experimento realizado por Marshall, 1985.
A bactéria
Bactéria gram-negativa.

Múltiplos Flagelos que garantem alta motilidade.

Essencialmente espiralada, mas pode-se apresentar de forma esférica, ou cocóide.

Mudanças na morfologia: fatores ambientais e condições de cultivo.

Forma cocóide VBNC.

Difícil cultivo - necessita de meios complexos.
Fonte: The Science Picture Company: http://www.sciencepicturecompany.com/
Patologia
Colonizadora de mucosas gástricas humanas.

Infecção Sintomática ou Assintomática.

Principal fator de risco para o desenvolvimento de gastrite, úlcera e câncer gástrico.

Associada a gastrites agudas e crônicas, úlcera péptica gástrica e duodenal, carcinoma gástrico, linfoma gástrico, entre outras.

Desenvolvimento de sintomas depende de fatores do hospedeiro e da bactéria.
Patologia
Urease - hidrolise da uréia -> modifica pH -> sobrevivência da bactéria no estômago.

Lipases, proteases e flagelos -> facilitam à aderencia à mucosa.

vacA
- gene que codifica a citotoxina vacuolizante -> produção de alcaloides -> dano ao DNA -> desenvolvimento de câncer.

cagA
- gene que codifica citotoxina vacuolizante associada.

Presença de
cagA
- risco 3 vezes maior de desenvolver câncer gástrico (Parsonnet et al, 1997).
Fatores de virulência da bactéria
Patologia
Fatores do hospedeiro
Resposta imune -> exacerbação de produção de anticorpos e citocinas -> inflamação -> lesão.

Geralmente Th1 e raramente Th2

Resposta por Th1 em camundongos ocasionou em maior risco de desenvolvimento de câncer gástrico nos animais infectados (Fox e Wang, 2002).
Epidemiologia
Infecção assintomática -> incidência determinada de forma indireta -> prevalência

Distribuição mundial, atingindo níveis de infecção superiores a 50% -> Questão de Saúde Pública.

Busca de IgG anti-
Helicobacter pylori
em Rondônia -> soropositividade de 78,9% (RIBEIRO et al, 2010).

Biópsias de pacientes com sintomas, em São Luís do Maranhão -> presença de
H. pylor
i em 96% dos casos (BEZERRA et al, 1996).

Biópsias de pacientes de Anápolis e Goiânia -> presença de
H. pylori
em 42% dos casos de gastrite e 50% de úlcera. (PACHECO, et al, 2008).
Prevenção?
Transmissão
Modo de transmissão não é completamente conhecido -> dificulta a prevenção

Sabe-se que pessoa a pessoa através de secreções corporais que incluem vomito, saliva, suco gástrico e fezes que contaminam alimentos e água

Água contaminada pode ser o principal veículo de infecção -> Bactéria escapa de mecanismos de tratamento de água
Evidências da Transmissão Aquática
Se associa ao plâncton, à matéria orgânica e à amebas de vida livre.

Também se associa à superfícies como biofilmes.

Adquire forma VBNC na água

Dificultam mais ainda o cultivo e impede o seu emprego como forma de monitoramento em estações de tratamento de água.

Evidências da Transmissão Aquática
Objetivos
Verificar a presença de
H. pylori
nos sistemas de abastecimento pelos rios João Leite e Meia Ponte e monitorar a persistência desse microrganismo nas águas tratadas, e associar a qualidade do saneamento básico com o índice de morbidade hospitalar por doenças associadas à infecção por esta bactéria no estado de Goiás, bem como analisar os gastos sócio-finânceiros relacionados à infecção por essa bactéria.
Coleta e Concentração de amostras de águas
Extração de DNA
Fenol-Clorofórmio adaptada de Sambrook (2006)
Agosto à Novembro de 2012:
8 Amostras Captação dos Rios Meia ponte (4) e João Leite (4)
13 amostras de 4 Reservatórios
13 amostras de 4 Pontos Residenciais
34 amostras filtradas a vácuo em uma membrana de nylon Millipore de espessura 0,45µm e resuspendidas em 5 mL com tampão T.E.
500 µl Fenol
+
500 µl amostra
5 minutos
10.000 rpm
5 min
Sobrenadante recuperado
+ quantidade de Clorofane = amostra restante
5 minutos
10.000 rpm
5 min
Sobrenadante recuperado
+ quantidade de Clorofil = amostra restante
5 minutos
10.000 rpm
5 min
Sobrenadante recuperado
1/10 NaCl
+
= quantidade de Isopropanol
5 minutos
10.000 rpm
5 min
5 minutos
10.000 rpm
5 min
Sobrenadante eliminado
Lavagem com 600 µl de Etanol (70% -20°C)
Sobrenadante eliminado
Resuspensão 40 µl de T.E. pH: 8,0
Armazenado a -20°C
Amplificação por PCR e Leitura por Eletroforese
Amplificação foi verificada por Eletroforese em Gel de Agarose à 0,8%, juntamente com peso molecular
Reativação da cultura de
H. pylori
Cepa de
H. pylori
de origem ATCC 43504

Fundação Oswaldo Cruz

Cultura mantida em Trypticase Soy Agar a 5% de CO2, a uma temperatura de 37 °C, durante 48 horas
Morbidade Hospitalar
Dados coletados do DataSUS/SIH

Entre setembro de 2012 e outubro de 2013

CID-10
K-29 - Gastrite e Duodenite
K-25, K-26, K-27 - Úlcera Gástrica e Duodenal
C-16 - Neoplasia Maligna de Estômago

Por macroregiões:
Centro Oeste, Centro Norte, Centro Sudeste, Nordeste e Sudoeste.
Saneamento
Dados coletados do DataSUS/IBGE

Ano 2000

Situação sanitária adequada, excluiu-se:
Fossas rudimentares, valas e outras escoamentos, bem como obtenção de água por cisternas e aqueles que não possuíam quaisquer instalações sanitárias

Por macroregiões:
Centro Oeste, Centro Norte, Centro Sudeste, Nordeste e Sudoeste.

Dados ajustados à população total do
mesmo ano.
Gasto público
Dados coletados do DataSUS/SIH

Setembro 2012 - Agosto 2013

Valor com serviços profissionais e hospitalares

Gasto público com pacientes por CID-10:
K-29 - Gastrite e Duodenite
K-25, K-26, K-27 - Úlcera Gástrica e Duodenal
C-16 - Neoplasia Maligna de Estômago

Por macroregiões:
Centro Oeste, Centro Norte, Centro Sudeste, Nordeste e Sudoeste.

Dados ajustados à porcentagem de
H. pylori
em biopsias gástricas de acordo com
Pacheco et al (2008)
Análise Molecular
Problemas enfrentados
Queda de energia no Instituto de Ciências Biológicas por mais 48 horas:

Perda da cultura reativada -> comprometimento contaminação artificial da água para validação da metodologia.

Transferência do material coletado e reagentes para Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública.
Análise Molecular
98 amostras coletadas
34 amostras analisadas
3 amostras positivas
2 amostras positivas de reservatórios
1 amostra positiva
de coleta residencial
8,82%
15,38%
7,69%
Análise Molecular
Morbidade Hospitalar
Morbidade Hospitalar
Saneamento
Saneamento
Gasto público total com Morbidade Hospitalar
Análise Molecular
A porosidade de 0,45µm é capaz de reter a bactéria e não o DNA livre.

Positividade de 8,82%:
Considerada baixa ao comparar com resultados de Santana em 2004 -> positividade de78% das águas dos mesmos rios.


Contaminação da água pode ser bem maior.
Análise Molecular
Baixa
positividade
Associações da bactéria como forma de resistência
Queda de Energia
Inibidores de polimerase presentes na água (KHAN et al, 2012)
Métodos de cloração e sua influência no DNA (JOHNSON et al, 1997; MORENO et al, 2007)
Análise Molecular
Positividade nos reservatórios e não em captações dos rios:

Indica participação de reservatórios como fonte de infecção.

Biofilmes no sistema de distribuição de água -> garante sobrevivência prolongada da bactéria.
Morbidade Hospitalar e Saneamento
Maior índice de morbidade nas regiões Centro Sudeste e Sudoeste:

Apesar do grande índice da população com acesso à saneamento.
Percurso dos rios João Leite e Meia Ponte após passarem pelas regiões mais industrializadas e se tornarem mais poluídos.
Despejo de Esgoto.

Provável rota de infecção por
H. pylori
no estado de Goiás.

A detecção de
H. pylori
em águas tratadas no município de Goiânia, juntamente com o alto índice de morbidade hospitalar por doenças gástricas associadas à infecção por esta bactéria e alto gasto de dinheiro público no tratamento dessas doenças, no estado de Goiás, tornam evidente a necessidade de maior interesse e investimento público em melhorias nos sistemas de tratamento de água e esgoto utilizados no estado.
Gasto público total com Morbidade Hospitalar
Gasto médio por Internação
Gasto médio por Internação
Gastos Públicos e Individuais
Gasto estimado com morbidade hospitalar
H. pylori
em 12 meses foi quase 1 milhão de reais!

Como esperado, regiões urbanizadas obtiveram maior gasto total e médio com doenças por
H. pylori
-> centros de referência em tratamento.


Gasto Individual com tratamento apenas de Gastrite e Úlcera pode totalizar quase 1 bilhão de reais!
Dados podem ser bem maiores:

Atendimentos pelo SUS são apenas 70% do total.

Dificuldade de acesso à serviços de saúde e consequentemente diagnóstico preciso.

Não disponibiliza índices reais de infecção por
H. pylori.

Ímpossibilidade de detecção no início da infecção -> infecção assintomática.
Valores obtidos e questionam os sistemas de tratamento de água como fonte promotoras de saúde.


Ilustram o alto gasto público com
H. pylori.



Indicam que investimento em saneamento capaz de deter essa bactéria é a medida mais econômica.
Gasto individual
Tratamento medicamentoso para gastrite e úlcera por
H. pylori

Primeira opção de tratamento segundo 3º Consenso Brasileiro para
H. pylori
(2013)

Inibidor da bomba de prótons em dose padrão, 2 vezes ao dia (Lansoprazol 30mg)
Antibiótico β-lactâmico de espectro moderado, 2 vezes ao dia(Amoxicilina 1g)
Antibiótico macrolídeo, 2 vezes ao dia (Claritromicina 500mg)
Omeprazol (Inibidor da bomba de prótons), prolongado

Ajuste dos valores em relação ao índice de contaminação
de 78,9% (RIBEIRO et al, 2010)
Gasto individual
H. pylori
sobrevive e prolifera melhor em águas do lençol freático e águas do mar que meio de cultura caldo Brucella enriquecido (KONISH et al, 2007)

H. pylori
perde capacidade de cultivo após 5 minutos de cloro na água, adquire forma viável mas não cultivável (VBNC) (MORENO et al, 2007)

No Peru, crianças que utilizavam águas municipais tinham maior prevalência (KLEIN et al, 1991).

Diversos trabalhos evidenciam a presença da bactéria em águas tratadas por detecção molecular.

Em 2004, Santana detectou por métodos moleculares, a presença de
H. pylori
em 78% dos rios que abastecem grande parte do estado de Goiás.
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