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PCR-Methoden zum Punktmutationsnachweis

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by

Mia Pries

on 18 December 2016

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Transcript of PCR-Methoden zum Punktmutationsnachweis

Auswertung
LNA-clamp-PCR
Neue Methode
Nachweis einer oder mehrerer bekannter Mutationen
Anwendung bei DNA-Gemisch
Verwendung modifizierter Nukelotide
PCR-Methoden zum Punktmutationsnachweis
Heteroduplexanalyse
Nachweis bekannter und unbekannter Mutationen
Beruht auf Entstehung von Heteroduplex aus Wildtyp- und mutierter Sequenz
Gellauf
LNA
"locked nucleic acid"
Modifiziertes RNA-Nukleotid
Hybridisiert mit höherer Affinität zu Doppelhelices als DNA-Nukleotide
Daraus resultiert erhöhte Schmelztemperatur
Prinzip
Gezielte Amplifikation eines mutierten Fragments
Gleichzeitige Unterdrückung des Wildtyps mittels Blocker/ "clamp"
Blocker = kurzes Oligonukleotid aus DNA und LNA
Ausnutzen unterschiedlicher Schmelztemperaturen bei komplementären und nicht komplementären Sequenzen
Quellen
Vielen Dank für eure Aufmerksamkeit!
Durchführung
Getrennte Amplifikation von Wildtyp und zu untersuchender Probe
Mischen beider Amplifikate
Denaturierung und Hybridisierung

Mögliche
PCR-Produkte
Homoduplex Wildtyp
Homoduplex Mutante
Heteroduplex Wildtyp-Mutante
Elektrophoresemarker
Homoduplex Wildtyp-DNA
Homoduplex Probe
DNA-Größenmarker
Auftragung auf Polyacrylamidgel
Dauer der Elektrophorese wird durch Fragmentlänge bestimmt z.B. 200bp = 14h
Durchführung
Ablauf
Herkömmlichen PCR + LNA-Blocker
Blocker bindet an alle Sequenzen
Löst sich bei Temperaturerhöhung von nicht komplementären Sequenzen ab
Blockiert nur Wildtyp-Sequenz
Anschließend Elektrophorese
Gellauf
http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0151654 (9.12.2016)

https://www.analytik-news.de/Dissertation/Schatz-Daniela.html (9.12.2016)

https://www.nationaldiagnostics.com/electrophoresis/article/heteroduplex-analysis (30.11.2016)

Klinische Pathophysiologie; Beatrice R. Amann-Vesti; ISBN 9783134496093; Georg Thieme Verlag; 2006

http://edoc.hu-berlin.de/dissertationen/daehmlow-steffen-2006-04-07/HTML/image022.gif (8.12.2016)

http://www.nationaldiagnostics.com/images/2_3_1a.gif (9.12.2016)


Single strand conformation polymorphism (SSCP)
Alternative zur Heteroduplexanalyse
Beruht auf unterschiedlicher Konformation von Einzelstrang-DNA
Durchführung
Durchführung einer gewöhnlichen PCR
Denaturieren der Doppelstränge
Auftrennen der Einzelstränge im Gel
Heteroduplex-Banden befinden sich oberhalb der Kontrollbanden
Bekannte Mutation = Bandenmuster spezifisch z.B. Brustkrebsmarker BRCA 1 & 2
Unbekannte Mutation = Isolierung entsprechender Banden
Anschließend Sequenzierung
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