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PCR (Reaccion en Cadena de la Polimerasa

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Antonio Campos

on 17 June 2014

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PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa
Técnica de biología molecular que desarrollada en 1987 por Kary Mullis
Componentes
Sabemos que el objetivo de la reacción en cadena de la polimerasa es obtener muchas copias de un fragmento de DNA, para después poder visualizar este fragmento y utilizarlo en otras aplicaciones si es necesario.
Para alcanzar este resultado, es necesario añadir a la reacción:

El DNA a partir del cual queremos obtener una copia de un fragmento, es decir, el DNA que queremos amplificar. Este DNA se conoce como DNA molde.

TAQ-POLIMERASA ya que es termoestable y elimina la necesidad de añadir nuevas cantidades de polimerasa durante el proceso de termociclado ya que el ADN polimerasa se inactiva a 90. De esta forma es posible utilizar un único tubo cerrado en una máquina de termociclado relativamente simple para realizar todo el proceso

Iniciadores de la reacción: Las enzimas DNA polimerasas únicamente son capaces de añadir nucleótidos al extremo 3’ libre de una doble cadena de DNA. Son necesarios por tanto moléculas cortas (entre 10 y 30 bases) de DNA de cadena sencilla.

Nucleótidos libres: las enzimas DNA polimerasas van a crear una cadena complementaria a la cadena molde mediante la incorporación de nucleótidos al extremo 3’ libre del cebador que se ha unido a la cadena molde. Los nucleótidos se añaden en forma de desoxirribonucleósidos trifosfato (dNTPs).

Estos cuatro componentes son los elementos básicos que es necesario incorporar a la reacción para que se complete una PCR.
que es y sus aplicaciones
Técnica de biología molecular desarrollada en 1987 por Kary Mullis, cuyo objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular,partiendo de un mínimo.

Esta técnica sirve para amplificar un fragmento de ADN; cuya utilidad es que tras la amplificación resulta mucho más fácil identificar con una muy alta probabilidad, virus o bacterias causantes de una enfermedad y detección de plagas de ellas, identificar personas (cadáveres) y animales e incluso obtener parentescos;también nos permite investigación científica sobre el ADN amplificado como la identificación de mutaciones o la evolución molecular.En el campo de la medicina nos ha permitido hacer diagnósticos sobre enfermedades hereditarias, estudiar la compatibilidad en trasplantes y predisposición a enfermedades

Estos usos derivados de la amplificación han hecho que se convierta en una técnica muy extendida, con el consiguiente abaratamiento del equipo necesario para llevarla a cabo.

Proceso de PCR
tipos de pcr
PCR anidada
El producto de una amplificación es utilizado como molde para realizar una segunda amplificación con cebadores que se ubican dentro de la primera secuencia amplificada, es decir, cuando tenemos la primera ampliación se pueden unir los cebadores y se hace de nuevo una amplificación dentro del amplición inicial
PCR in situ
Técnica que toma lugar dentro de la célula en tejidos fijados que permite detectar cantidades pequeñísimas de genoma.
Esta tecnología es de gran alcance en la capacidad de amplificar específicamente una población de secuencias de menor representación.
PCR multiplex
Amplifica simultáneamente más de una secuencia. Para ello, se combinan dos o más pares de cebadores en un mismo tubo, junto con el resto de los reactivos de la reacción en cantidades suficientes, para amplificar simultáneamente varios segmentos de ADN
PCR en tiempo real
o
PCR cuantitativo
Técnica cuya principal característica es que permite cuantificar la cantidad de ADN o ARN presente en la muestra original.

Esta técnica nos permite estudios de la expresión génica, valorar el efecto de una terapia... etc.

RT-PCR
Variante de la PCR en la que usamos ARN como molde inicial en vez de ADN, y emplea una transcriptasa inversa

1er paso: retrotranscripción a partir del ARN.
2º paso: amplificación a partir de la primera hebra de ADNc.
3er paso: PCR estándar.

Desnaturalización
En primer lugar, se desnaturaliza el ADN (se separan las dos cadenas de las cuales está constituido). Este paso puede realizarse de diferentes modos, siendo el calentamiento (94-95 °C) de la muestra la forma más habitual. La temperatura a la cual se decide realizar la desnaturalización depende, por ejemplo, de la proporción de G+C que tenga la cadena, como también del largo de la misma. Otros métodos, raramente empleados en la técnica de la PCR, serían la adición de sales o agentes químicos capaces de realizar la desnaturalización.
Extensión
o
Elongación de la cadena
Actúa la ADN polimerasa, tomando el ADN molde para sintetizar la cadena complementaria y partiendo del cebador como soporte inicial necesario para la síntesis de nuevo ADN. La polimerasa sintetiza una nueva hebra de ADN complementaria a la hebra molde añadiendo los dNTP complementarios en dirección 5'→ 3', uniendo el grupo 5'-fosfato de los dNTP con el grupo 3'-hidroxilo del final de la hebra de ADN creciente (la cual se extiende). La temperatura para este paso depende del ADN polimerasa que usemos. Para la polimerasa Taq, la temperatura de máxima actividad está en 75-80 °C (comúnmente 72 °C). El tiempo de extensión depende tanto de el ADN polimerasa usada como de la longitud del fragmento de ADN que se va a amplificar. Hay una regla comúnmente usada: en su temperatura óptima, la polimerasa de ADN polimerizará mil bases en un minuto.
Alineamiento
o
unión del cebador
Se producirá la hibridación del cebador, es decir, el cebador se unirá a su secuencia complementaria en el ADN molde. Para ello es necesario bajar la temperatura a 40-68 °C durante 20-40 segundos (según el caso), permitiendo así el alineamiento. Los puentes de hidrógeno estables entre las cadenas de ADN (unión ADN-ADN) sólo se forman cuando la secuencia del cebador es muy similar a la secuencia del ADN molde. La polimerasa une el híbrido de la cadena molde y el cebador, y empieza a sintetizar ADN. Los cebadores actuarán como límites de la región de la molécula que va a ser amplificada.
Inicio
Este paso consiste en llevar la reacción hasta una temperatura de 94-96 °C (ó 98 °C si se está usando una polimerasa termoestable extrema), que se mantiene durante 1-9 minutos. Esto sólo es necesario para ADN polimerasas que requieran activación por calor.
Conservación
Este es un paso que se lleva a cabo a 4-15 °C durante un tiempo indefinido para conservar la reacción a corto plazo.
La PCR normalmente se realiza con un volumen de reacción de 15-100 μL, en pequeños tubos de 0.2-0.5 mL que se colocan en el termociclador.

Elongación final
Etapa única que se lleva a cabo a una temperatura de 70-74 °C durante 5-15 minutos tras el último ciclo de PCR. Con ella se asegura que cualquier ADN de cadena simple restante sea totalmente ampliado.
http://riunet.upv.es/bitstream/handle/10251/10700/Reacci%C3%B3n%20en%20cadena%20de%20la%20polimerasa.pdf

http://es.wikipedia.org/wiki/Reacci%C3%B3n_en_cadena_de_la_polimerasa

http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/capacitybuilding/manuals/Manual%20ES/Sesi%C3%B3n6.pdf

http://www.monografias.com/trabajos11/tamau/tamau.shtml

http://es.wikipedia.org/wiki/Partidor

http://www.eead.csic.es/compbio/material/algoritmos3D/node26.html
GRACIAS.
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