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CRISTALLIZZAZIONE LISOZIMA 5°D

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by

quintaD zanelli

on 22 March 2015

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Transcript of CRISTALLIZZAZIONE LISOZIMA 5°D

I
l lisozima fu scoperto casualmente nel 1922 da
A.Fleming
, il padre della penicillina, mentre svolgeva studi atti alla ricerca di nuovi farmaci antibiotici.

Notò che nelle colture batteriche dov'era stato aggiunto del muco, la crescita dei batteri si arrestava.
Meccanismo
d'azione
Dove...
I
l lisozima è presente in numerose
secrezioni umane
:
saliva, lacrime, muco e latte materno.
In ambito industriale viene estratto dall'albume d'uovo, ed è abbondantemente impiegato nell'industria lattiero-casearia, nonché in campo enologico come conservante, grazie alle sue
proprietà battericide
.
Come e quando...
Perchè...
L
a cristallizzazione di proteine è di fondamentale
importanza nel campo delle scienze biochimiche,
biologiche e biotecnologiche.
Difficoltà...
N
onostante i notevoli sviluppi nelle tecniche impiegate per cristallizzare ed analizzare le proteine, la parte più difficile di tale procedura rimane quella di
ottenere cristalli
con caratteristiche opportune in termini di
dimensioni
(> 50-100 μm) e
potere diffrangente
, il quale è strettamente legato alle caratteristiche del cristallo.
Obiettivi...
STORIA
SCOPO
CRISTALLIZZAZIONE
del
LISOZIMA

Chi...
I
batteri Gram positivi possiedono uno strato di peptidoglicano più abbondante (spesso 800 Å) rispetto ai Gram negativi (due strati uno di peptidoglicano e uno lipoproteico complessivamente spessi 200 Å), motivo per il quale il lisozima agisce prevalentemente su di essi.
Struttura
I
l lisozima è formato da una catena polipeptidica di
129 amminoacidi
che si organizzano in
due domini,
uno composto da
alpha-eliche
e uno da
beta-foglietti,
stabilizzati da
tre ponti disolfuro.
Ha un sito attivo a forma di lunga fenditura che si lega alle catene di carboidrati della parete cellulare dei batteri.

Basandosi sui modelli molecolari al computer, è stato proposto che il lisozima determini la distorsione della forma di uno degli anelli di zucchero della catena, rendendolo più facile da rompere.
I
l lisozima catalizza una reazione di idrolisi della parete batterica, in particolare del
peptidoglicano
, un polimero responsabile della rigidità delle pareti batteriche, costituito da due unità legate fra loro, il
NAG
( N-acetilglucosammina) e il
NAMA
( N-acetilmuramico).
L'enzima idrolizza il legame tra le due unità danneggiando la parete batterica, provocando la morte della cellula per shock osmotico.
L
'analisi di una proteina cristallizzata tramite la diffrazione ai raggi X permette ad esempio di:

- progettare farmaci

-individuare le forme polimorfe
in cui una sostanza cristallizza nelle diverse condizioni operative. Il polimorfismo è quel fenomeno in base al quale una sostanza, al variare delle condizioni in cui avviene il fenomeno, cristallizza in due o più forme diverse.
PRINCIPIO DELLA CRISTALLIZZAZIONE
L
a
cristallizzazione
è un mezzo di purificazione che permette la produzione di quantità limitate di materiale proteico ad elevato grado di purezza.
I principali metodi di
cristallizzazione delle proteine sono:
-
Diffusione del Vapore
-
Micro-Batch

Il metodo della diffusione del vapore presenta due diverse procedure:
-
Hanging drop
-
Sitting drop
Hanging drop
N
ella diffusione del vapore, una goccia contenente una miscela di soluzione precipitante e proteine è sigillata in una camera con precipitante a concentrazione doppia rispetto a quella della goccia. La
concentrazione del precipitante nella goccia si equilibrerà con la concentrazione del precipitante nel pozzetto
attraverso diffusione di vapore, in modo da provocare una nucleazione cristallina.
Sitting drop
S
tesso principio base dell’hanging drop, a parte che la goccia viene posata su un ponticello sistemato sopra il pozzetto (sistema chiuso). Ciò permette di poter utilizzare gocce più grandi, manipolare meglio gli eventuali cristalli, e avere un migliore isolamento termico.
Micro-batch
I
n un esperimento di micro-batch, la soluzione di proteina è mescolata ad un agente precipitante che rende istantaneamente la soluzione sovrasatura. Questa è ricoperta con olio di paraffina, in modo da non permettere diffusione di acqua, facendo rimanere la concentrazione dei reagenti nella goccia pressochè costante.
PROCEDIMENTO
MATERIALI:

• Piastra con i pozzetti
• Micropipette da 1 mL e da 2 uL
• Microscopi
• Pipette
• Propipette
• Becker
• Provette
• pHmetro


MATERIALE CHIMICO:


Lisozima
50 mg/mL

• Cloruro di sodio
3M
• Tampone citrato
pH 3,5
• Tampone fosfato
pH 6,5
• Tampone acetato
pH 4,5 e 5,5
• Acqua deionizzata


1.
Preparare 24 soluzioni come in tabella utilizzando
le soluzioni precedentemente elencate.



2.
Utilizzando una micropripetta inserire in ogni
pozzetto 0,5 mL una diversa soluzione
precipitante.


4.
Aggiungere 2 uL della stessa soluzione
presente nel pozzetto sul vetrino
coprioggetto.

5.
Cospargere con vaselina il bordo di ciascun
pozzetto.






6.
Adagiare il vetrino coprioggetto sul rispettivo
pozzetto.

7.
Dopo un'ora osservare al microscopio per verificare se si sono formati cristalli.

Lo studio della
struttura tridimensionale
delle proteine attraverso la
diffrazione di raggi X
di un cristallo si è rilevato uno strumento essenziale per la comprensione di numerosi meccanismi biochimici per i sistemi viventi.

La conoscenza della struttura tridimensionale di una proteina rappresenta un elemento indispensabile per la ricerca di molecole in grado di controllarne l’attività biologica.
Schema di diffrazione elettronica ottenuta da un quasicristallo icosaedrico

3
. Prelevare 2 uL di soluzione di
lisozima e posizionarla
centralmente sul vetrino
coprioggetto.
Risultati
Cristalli dodecaedrici con 4 facce esagonali e 2 facce laterali costituite da 8 quadrati.
Macro di un cristallo
Ingrandimento maggiore
Risultati
: i cristalli si sono formati più velocemente e in numero maggiore nel pozzetto
A1
a
pH 3,5
concentrazione di NaCl
0,6 M
Progetto svolto dalle classi 5°D e 5°F
dell'Istituto d'
Istruzione Superiore A. Zanelli
di Reggio Emilia
a.s. 2014/2015
in collaborazione con
l'università di Modena e Reggio.



GRAZIE PER L' ATTENZIONE!
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