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TESIS-PECTINA EN LA CÁSCARA DE CACAO

VALIDACIÓN DEL MÉTODO PARA LA DETERMINACIÓN DE PECTINA EN LA CÁSCARA DE CACAO
by

Alex Robayo

on 1 November 2015

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2. RESUMEN
El presente trabajo validó un método espectrofotométrico visible para determinar el contenido de pectina en la cáscara de seis clones distintos de
Theobroma cacao
L (
ICS 60, TSH 565, ICS 95,

EET 8, CCN 51
,
SCC 61
) de los municipios de Falán, Chaparral y Villarrica (Departamento del Tolima); Algeciras y Garzón (Departamento del Huila); y San Vicente de Chucurí (Departamento de Santander).

3. INTRODUCCIÓN
En Colombia existen pocos estudios que abordan el uso de la pectina en la cáscara de cacao y por tanto no hay un método normalizado.
VALIDACIÓN DEL MÉTODO PARA LA DETERMINACIÓN DE PECTINA EN CÁSCARA DE CACAO
Trabajo de Grado para optar al título de Licenciatura en Química
EDWIN ALEXANDER ROBAYO CHAPARRO
DIRECTORES
ANDREA ELISA GARCÍA
M. Sc. Ciencias Farmacéuticas
Y
HUGO RODOLFO JIMÉNEZ SABOGAL
Ph.D. Microbiología
Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria CORPOICA

CODIRECTORA
BERTA INÉS DELGADO FAJARDO
Profesora Titular Universidad Distrital Francisco José de Caldas
Grupo de Investigación Química Ambiental

Es una entidad pública por servicios con régimen privado, encargada de generar conocimiento científico y soluciones tecnológicas en beneficio del sector agropecuario colombiano.
http://www.corpoica.org.co/SitioWeb/Corpoica/Corpoica.asp
http://www.corpoica.org.co/SitioWeb/Default.asp
UBICACIÓN:
Con un área de 564 hectárea se localiza a 4º 42' Latitud Norte y 74º 12' Longitud Oeste.
El cacao del genero
Theobroma
es una especie nativa de los bosques húmedos tropicales de América del sur. El nombre genérico teobroma significa literalmente “Comida de los Dioses” (Nair, 2010). A las semillas también se les denomina como cacao.
6.1. Theobroma Cacao
L.
BIBLIOGRAFÍA
MORFOLOGÍA
Es un arbusto semicaducifolio que tiene un intervalo de altura de 4 a 8 metros en cultivos.
LA FLOR
EL FRUTO
http://www.pdrs.org.pe/img_upload_pdrs/36c22b17acbae902af95f805cbae1ec5/Hoja_Bot_nica___Cacao___2012.pdf
(consultado noviembre de 2012).
http://www.pdrs.org.pe/img_upload_pdrs/36c22b17acbae902af95f805cbae1ec5/Hoja_Bot_nica___Cacao___2012.pdf (consultado noviembre de 2012).
En la explotación del cacao solo se aprovecha las almendras, que constituye entre el 10% al 19% del fruto completo en fresco. (Barazarte, 2008 y Vriesmann 2011).
Lo anterior origina una alta producción de desechos constituidos en su mayoría por la cáscara. Ocasionando que el país pierda cerca del 50% de su producción por el manejo inadecuado de la disposición final de la cáscara y conlleva a los problemas fitosanitarios como
Moniliophthora rorer
i,
Moniliophthora perniciosa
y
Phytophthora sp
(Aranzazu, 2010).
Jaimes Y, Aranzazu F. Manejo de las enfermedades del cacao (Theobroma cacao L.) en Colombia, con énfasis en monilia (Moniliophthora roreri). Bucaramanga-Colombia: Corpoica, Fedecacao, Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural; 2010. 31 p.
http://www.pdrs.org.pe/img_upload_pdrs/36c22b17acbae902af95f805cbae1ec5/Hoja_Bot_nica___Cacao___2012.pdf.
Aranzazu Hernández LF, Martínez Guerrero N, Rincón-Guarín DA, Palencia Calderon GE. Materiales de cacao en Colombia, su compatibilidad sexual y modelos de siembra. Rural CMdAyD, Fedecacao FNdC, editors. Bucaramanga-Santander, Colombia: Corpoica, Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural, Fedecacao, Federación Nacional de Cacaoteros; 2009. 29 p.
En la medida que se disponga de métodos validados se contribuye a disminuir los problemas ambientales y adicionalmente tendría un valor agregado.
5. OBJETIVOS
6.2. PECTINAS
6.4. VALIDACIÓN
8.5.2. Características de desempeño del método analítico
8.5.3. Determinación de pectina
y Análisis estadístico
GRACIAS
1. ¿QUÉ ES CORPOICA?
BOGOTÁ D.C. 2015
Colombia alcanzó desde el 2009 al 2014 un área de siembra 134.904 a 199.000 ha.
Producción anual de cáscara de cacao (Fedecacao, 2015).
40,0%
5,2%
7,0%
La cáscara como residuo agroindustrial tiene un potencial como fuente de pectina (Barazarte, 2008). Y en Colombia existe un limitado conocimiento sobre ello, y la diferencia de la concentración entre los clones objeto de estudio.
CONTENIDO
1. Qué es Corpoica
2. Resumen
3. Introducción
4. Planteamiento del Problema
5. Objetivos
6. Marco Teórico
7. Metodología
8. Resultados
9. Conclusiones
10. Recomendaciones

8% a 11% de Pectina a base seca.
Modificado de http://www.purewellbeing.com/contents/en-uk/d87_Cacao.html
Alimentaria
Pecuaria
Farmacéutica
La pectina es un producto importante a nivel industrial
4. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Por consiguiente, el presente trabajo validó un método espectrofotométrico para determinar el contenido de pectina las cáscaras de cacao de los clones de mayor producción a nivel nacional.
25.000 familias (Aranzazu, 2009).
http://www.portafolio.co/negocios/los-cacaoteros-buscan-mas-y-nuevos-mercados-el-grano
Precio internacional de Cacao ($US/ton)
Fuente: Bolsa de Nueva York
http://www.agronet.gov.co/agronetweb1/
Colombia exporto en el 2014 (Fedecacao, 2015)
:
En Octubre de 2015 el kg en Colombia cuesta en promedio $7.700 según la Bolsa de Nueva York
http://www.fedecacao.com.co/site/index.php/14-cat-precios/30-art-nov-precio-del-cacao
http://www.fedecacao.com.co/site/index.php/14-cat-precios/30-art-nov-precio-del-cacao
Es un cultivo amigable con el ambiente y la biodiversidad, ya que, es compatible con la diversificación de otros cultivos.
http://www.plantasdenaturopata.com/cacao-html/
5.1. Objetivo General:
Validar el método para la determinación de pectina en cáscaras de cacao.

5.2. Objetivos Específicos
Optimizar los criterios de desempeño del método analítico espectrofotométrico ultravioleta-visible en la determinación de pectina.
Cuantificar por el método espectrofotométrico visible los contenidos de pectina presente en la cáscara de diferentes materiales de cacao localizados en seis Municipios de Colombia.

6. MARCO TEÓRICO
http://www.catie.ac.cr/BancoConocimiento/C/colecciones_jardin_botanico_botanica_del_cacao.asp?CodIdioma=ESP
http://www.pdrs.org.pe/img_upload_pdrs/36c22b17acbae902af95f805cbae1ec5/Hoja_Bot_nica___Cacao___2012.pdf
300 T anuales mercado equivalente a US$ 2.700.000
Son heteropolisacáridos estructurales complejos y de alto peso molecular presentes en las paredes celulares vegetales. Se estima que el 90% de ácidos urónicos en la pared celular vegetal es de
Galp
A y el 70% de la pectina presente la conforman los monómeros de GalpA.
Adaptado de Leclere L, Van Cutsem P, Michiels C. Anti-cancer activities of pH- or heat-modified pectin. Frontiers in Pharmacology. 2013;4.
6.3. ESPECTROFOTOMETRÍA
UV-VIS

Es un método analítico basado en la interacción de la materia y la radiación electromagnética comprendida en las regiones ultravioleta cercano y visible, infrarrojo cercano -200 y 2.500 nm-, midiendo la absorbancia o la transmitancia de la luz de las sustancias.
X+ hv X* X + fotones o calor
Colores en las distintas regiones de longitud de onda
Los tres tipos de energía están cuantizados, es decir, se encuentran en niveles discretos.
Olsen, E. D. (1990). Métodos ópticos de análisis. Barcelona, España, Reverté. p 112.
Cuando ocurre la transición electrónica en muestras líquidas o sólidas, a ellas se sobreponen transiciones vibracionales y rotacionales de las moléculas y están más impedidas.
http://repositorio.innovacionumh.es/Proyectos/P_22CursoMateriales/Miguel_Angel_Sogorb/Wimba/Espectroscopia_03.htm
Autor
Ley de Lambert-Beer
Plantea cuantitativamente el grado de atenuación depende de la concentración de las moléculas absorbentes y de la longitud del trayecto.
Adaptado de Zagatto, E. A. G., et al. (2012). Capitulo 4 - Interaction of Radiation with the Flowing Sample. Flow Analysis with Spectrophotometric and Luminometric Detection. E. A. G. Z. C. O. T. J. Worsfold. Amsterdam, Elsevier: p 95-146.
Desviaciones a le Ley de Beer
Adaptado de Hernández LH, Pérez CG. Introducción al análisis instrumental. ilustrada ed. Ciencia A, editor. Barcelona, España: Ariel; 2002. p 48.
Instrumentación de la espectrofotometría UV-VIS
Adaptado de Omicrono, Beer law, tomado en línea http://www.omicrono.com/wp-content/uploads/2013/06/beer-law-e1370190984433.jpg

La validación de un método analítico es el proceso que tiene como objetivo demostrar sí la capacidad del método satisface los requisitos para la aplicación analítica deseada (Díaz, 1998).
La
validación
no se puede confundir con
verificación
.
Las características de fiabilidad son las que demuestran la capacidad de un método analítico para mantener a lo largo del tiempo “criterios de desempeño en la validación”:
Selectividad
Linealidad
Límite de detección (LD)
Límite de cuantificación (LC)
Precisión
Exactitud
Robustez
7. METODOLOGÍA
El presente trabajo se desarrolló en el Laboratorio de Nutrición Animal (L.N.A.) del CBB de Corpoica.
Existen diferencias entre las concentraciones de pectina en las cáscaras de los mismos clones de
Theobroma cacao
L cosechados en las diferentes regiones del país.
El trabajo consistió en cinco etapas:
8. RESULTADOS
Y DISCUSIÓN
8.1. Selección y procedencia
del material biológico

Las muestras de
Theobroma cacao
L. fueron suministradas por el L. N. A.
Julio-Agosto del 2012
Mayor a 2 años y menor a 10 años
7.5.
Validación del método analítico para cuantificación de pectina en cáscara de cacao por espectrofotometría UV-VIS:

7.5.1.
Calificación del equipo.
7.5.2.
Características de desempeño del método analítico.
7.5.3.
Determinación de pectina y Análisis estadístico.
7.1.
Selección y procedencia del material biológico.
7.3.
Caracterización de los clones de
Theobroma cacao
L.
8.3. Caracterización de los
clones de
Theobroma cacao
L.
Se caracterizaron morfológicamente empleando la metodología usada en los descriptores del CATIE.
Clon CCN 51 de Algeciras pesa 1.041,5 g a diferencia del Clon ICS 95 de Chaparral que pesa 292,4 g.
Clones CCN 51 con 804,5 g y EET 8 con 807,3 g de Algeciras y el clon ICS 95 con 213,8 g de Chaparral.
Clones CCN 51 con 123,5 g y SCC 61 con 125,4 g de Algeciras y el clon ICS 95 con 55,3 g de Chaparral.
Los clones trabajados reportan una humedad de 73,7 a 86,5% no importando la cantidad de materia.
El clon ICS 95 (26,3%) de Chaparral que presentó menor masa en fruto y cáscara.
7.2.
Pretratamiento del material biológico.
8.2. Pretratamiento
del material biológico.
7.4.
Extracción de la pectina.
8.4. Extracción de la pectina
La extracción de pectina se basó en el método propuesto por Mollea y col. 2008 y Emaga y col. 2008 modificado.
Centrifugo: 6000 rpm/15 minutos
Polifenoles y melanoidinas (carbohidrato-aminoácido)
0,05 g de carbón activado
Darco® G-60 J.T. Baker®
30 s
5000 rpm/7min
Filtro membrana 0,45 µm
Cuantificación: método modificado de Blumenkrantz y Asboe-Hansen (1973).
Fd=40, V=0,5mL, V= 3,0 mL H2SO4/Boráx
T.ambiente, Vortex, T=90±5ºC/5min.
5-formil-2-furanocarboxilico 5-FFA
50 µL MHDF y 523 nm.
Complejo 5FFA/MHDF
8.5. Validación del método analítico para cuantificación de pectina en cáscara de cacao por espectrofotometría UV-VIS.
8.5.1. Calificación del equipo (EQ)
Calificación de Instalación (IQ)
La conexión del cable de datos, redes eléctricas, nivelación del suelo, lugar aislado de interferencias como vibraciones y corrientes de aire. Técnico de Biotek
Calificación Operacional (OQ)
Software y el Instrumento respondieran. Técnico.
Calificación de desempeño (PQ)
Respuestas generadas del equipo Synergy HT™ Lector Multi-Modal de Microplacas a dos concentraciones distintas.
Se consideró la NTC-ISO/IEC 17025 del 2005
Linealidad
Límite de detección
Límite de cuantificación
Selectividad
Precisión
Exactitud
Linealidad
S/n Stock 200 ppm en días distintos.
t-Student para saber si hay correlación en la UA y [C]
Límite de Detección y Límite de Cuantificación
El límite de detección se evaluó considerando la relación señal/ruido y la respuesta del espectrofotómetro Synergy HT™ a una solución de blancos.
LD=5,62mg/L
El límite de cuantificación es definido por la IUPAC como la menor concentración de analito que puede determinarse con precisión y exactitud.
LC= 6.96mg/L
Selectividad
Se realizó los espectros por triplicado.
La pectina es un heteropolisacárido:Gal, Glc, Rha, Ara, Fru, Sac, Mal y Rap.
Rigurosidad: analítica se realizó la corrección modificada propuesta por Kintner y Van Buren (1982). Para estimar GalA.
Butanol: ácido acético: agua, 2:1:1
2,7-Naftalenodiol
Difenilamina/Anilina 1:1 solución 4% en acetona

Lamb máx. 510 a 545 nm
Precisión
La precisión se evaluó sobre el sistema y el método. Realizando para repetibilidad las siguientes condiciones:
mismo analista, mismo día, mismo instrumento
. Y para reproducibilidad:
mismo analista, diferente día, mismo instrumento
.
Repetibilidad del sistema: estándar D-GalA
Reproducibilidad del sistema: estándar D-GalA
Repetibilidad del método: Clon EET 8 Chaparral
Reproducibilidad del método: Clon EET 8 Chaparral
Exactitud
Se evaluó la exactitud del sistema y del método
Exactitud y precisión del estándar D-GalA.
Matriz enriquecida con 3 niveles del estándar D-GalA
Porcentaje de recuperación para los tres niveles de enriquecimiento
Hipótesis
Estabilidad del complejo 5FFA/MHDF en la matriz
Agrupamiento de Tukey para el clon EET 8 en los diferentes municipios
Agrupamiento de Tukey para el clon TSH 565 en los diferentes municipios
Agrupamiento de Tukey para el clon ICS 60 en los diferentes municipios
Agrupamiento de Tukey para el clon CCN 51 en los diferentes municipios
Agrupamiento de Tukey para el clon ICS 95 en los diferentes municipios
Agrupamiento de Tukey para el clon SCC 61 en los diferentes municipios
9. CONCLUSIONES
Se estableció las condiciones por el método espectrofotométrico Uv-Vis para determinar pectina en matrices de cáscara de cacao. Se utilizó el equipo Synergy HT™ Lector Multi-Modal de Microplacas, cumpliendo satisfactoriamente cada uno de los criterios de desempeño como linealidad, límite de detección, límite de cuantificación, selectividad, precisión, exactitud.
Se establecieron las condiciones para extraer pectina en cáscara de cacao, en dos tiempos. El primero con una solución H2SO4 3%p/v a pH 0,750±0,050 proporciones 1:30 p/v a una temperatura de 90ºC durante 1 hora. El segundo con H2O destilada y desionizada a pH 7,050±0,050 en las mismas proporciones y condiciones, pero la temperatura de 85ºC.
El complejo 5FFA/MHDF se degrada posterior a los 20 minutos, disminuyendo su absorbancia después de este tiempo.
De acuerdo con las concentraciones de pectina encontradas en los clones de Theobroma cacao L correspondientes a los municipios de Falán, Chaparral y Villarrica (Departamento del Tolima), Algeciras y Garzón (Departamento del Huila) y San Vicente de Chucurí (Departamento de Santander) sería posible utilizar la cáscara como materia prima de pectina en la industria alimenticia y farmacéutica.
El contenido de pectina varía en los mismos clones para los distintos municipios.
10. RECOMENDACIONES
Se sugiere cambiar el reactivo de coloración cada dos meses, y las condiciones de preservación son a una temperatura de 5 °C y aislado de la energía electromagnética.
Se recomienda para estudios posteriores la posibilidad de usar como medio extractante ácido cítrico, ya que es un reactivo que no es controlado como el ácido sulfúrico y en estudios realizados en otras matrices genera buenos rendimientos de pectina.
Se recomienda usar un medio de purificación, como la precipitación con etanol, ya que con este disminuirían los costos del análisis, puesto que no sería necesario el uso de filtros de membrana haciéndolo más rentable.
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