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BdA

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by

Erika Matsuda

on 26 June 2014

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Transcript of BdA

Ensaio experimental para a produção e extração de antraquinonas de
Fusarium
sp.

Discentes:
Andressa Lie Mizobuchi
Érika Yumi Hashizumi Matsuda
Franciana Luísa Aguiar
Tamires Lie Yamamoto
Vinícius de Souza

Docente:
Prof. Me. Bruno Henrique de Oliveira
Assis – SP
Junho de 2014

Materiais e Métodos
Microrganismo utilizado e condições de reativação e manutenção da cultura
Fungo filamentoso
Fusarium
sp.
Reativação em placa de Petri:
meios MEA (extrato de malte 2,5% e agar 2%) e BDA (3,9%), 28˚C por 7 dias

Manutenção da linhagem a cada 15 dias em meio MEA

Esterilização
Todos os materiais e meios foram
esterilizados em autoclave
(121˚C e 1 kgf/cm^2) por 15 minutos.
Pré-inóculo

Inóculo de 3 esferas (d=0,5 cm) compostas por micélios do fungo em meio sólido em Erlenmeyers (125 mL) com 25 mL de meio

Incubação em shaker, 28˚C a 180 rpm por 11 dias em meios:

Meio 1: Extrato de levedura 1,5% e sacarose 1,5%
Meio 2: Extrato de levedura 1%, sacarose 0,5% e óleo de milho 2%
Meio 3: Extrato de levedura 1% e óleo de milho 2%
Fermentação
(Produção de antraquinonas)

Inóculo de 10 mL do
Fusarium
sp., crescido em meio 3, em Erlenmeyers (250 mL) contendo 50 mL de meio:

MEA líquido (extrato de malte 2,5%)
Meio 4: Extrato de levedura 0,5% e óleo de milho 1,5%
Incubação em shaker, 28˚C a 180 rpm por 14 dias
Influência da luminosidade

Encapamento da metade dos Erlenmeyers com papel alumínio

Extração das antraquinonas

Filtração do conteúdo do Erlenmeyer com gaze e algodão

Secagem da biomassa com coloração roxa no cadinho em estufa a 70˚C por 1 hora
Adição de álcool etílico (proporção de 135mL/g de biomassa), homogeneização e maceração

Filtração com funil e papel de Whatman

Extrações sucessivas com solventes de diferentes polaridades:

Acetato de etila
Éter
Álcool etílico
Água
As frações líquidas obtidas foram secas em capela a temperatura ambiente
Influência do pH nos pigmentos extraídos

Após a secagem, tratamento com soluções ácidas e básicas
Ácido clorídrico (HCl) 6 M
Hidróxido de sódio (NaOH) 4 M

Solubilidade da biomassa seca em:

Leite condensado
Leite condensado + leite
Leite condensado + leite + água
Leite condensado + leite + água + óleo de milho

Introdução
COR
Principal característica organoléptica
Associada à qualidade, do ponto de vista do consumidor, com grande influência na compra
CORANTE
Portaria SVS/MS 540/97:


“a substância ou a mistura de substâncias que possuem a
propriedade de conferir ou intensificar a coloração de alimento (e bebida).”

CORANTE
Do estado excitado ao estado basal elétrons emitem energia com diferentes ƛ.
Constituído de cromóforos diversas cores e intensidades
HISTÓRICO
5.000 a.C. egípcios: hena e carmim;

2.500 a.C. tecidos coloridos e inscrições rupestres;

1.500 a.C. corantes em alimentos;
Influência na história do BRASIL
Caesalpinia echinata
(“pau-brasil”);

Indigofera tinctoria
no século XIX.
CORANTES NATURAIS
Fontes: plantas, insetos e micro-organismos

Dividos em: tetrapirrólicos;
isoprenóides;
N-heterocíclicos;
derivados benzopiranos;
derivados de processamento;
quinonas.

CORANTES NATURAIS
Atividade corante e biológica;

Estabilidade dos pigmentos;

Possibilidade de produção.

CORANTES NATURAIS


Antioxidantes;
Antiinflamatório;
Prevenção de doenças crônicas não transmissíveis;
Antitumoral;
Antimicrobiano;
Anticarcinogênico.
Saúde:
CORANTE SINTÉTICO/ARTIFICIAL
1856: Willian Henry Perkin mauveína;






Substitui corantes naturais:
baixo custo;
perto dos centros consumidores (laboratórios);
homogeneidade da composição;
garantia de qualidade como corante
CORANTE SINTÉTICO/ARTIFICIAL
Desvantagens:

Alergias, intoxicação, mutagênese, problemas respiratórios, desenvolvimento de doenças degenerativas e etc.;

Riscos nas etapas de biotransformação substâncias carcinogênicas e mutagênicas;

Bioacúmulo depósito crescente de poluentes em nível tecidual;

Sofrer redução e perda de cor;

Aumentam a turbidez da água impedem a penetração da luz, diminuindo atividade fotossintética e provocando distúrbios na solubilidade dos gases;

Causam danos nas brânquias dos peixes.

Tabela 1:
a origem e efeitos dos corantes sintéticos permitidos no Brasil. A ANVISA prevê a indicação no rótulo sobre a sua condição sintética e ingestão diária aceitável. Fonte: Meinicke, 2008.
CORANTE SINTÉTICO/ARTIFICIAL
Testes de mutagenicidade e/ou carcionogenicidade em corantes para alimentos:
+ para corantes sintéticos: vermelho escarlate, amarelo-manteiga e Green S.

Uso
RESTRITO
ou
PROIBIDO
!
Exemplo: Amaranto, Laranja I e Ponceau 3R banidos no EUA (apenas 5 sintéticos permitidos).
CORANTE SINTÉTICO/ARTIFICIAL
População infantil é a mais vulnerável: ingerem maior quantidade de aditivos!

Exemplo:
corantes amarelo crepúsculo e amaranto encontrado no pó para gelatina e o preparado sólido para refresco e refrigerante acima do estipulado pela legislação (SCHUMANN
et al
., 2008).
CORANTE SINTÉTICO/ARTIFICIAL
Consumo diário de corantes sintéticos em alimentos e bebidas:
CODEX ALIMENTARIUS: pesquisas e publicações sintéticos PROIBIDOS!
Exemplo: amarelo sólido: gelatinas;

laranja GGN: pós para sorvetes;

escarlate GN: recheio de confeitarias;

azul de alizarina: óleos emulsionados e gelatinas.
CORANTES NATURAIS
CONSUMIDORES produtos naturais menos danos à saúde e ao meio ambiente!



Corantes naturais:
vantagem no tratamento de efluentes;
diminuiu o custo;
fácil acessibilidade;
abundância de matéria-prima;
pressão de órgãos regulamentadores.

CORANTES NATURAIS
Indústrias de corantes naturais para alimentos: crescimento anual de 5-10%.



Líderes: CHr. Hansen (Dinamarca); Warner-Jenkinson Europe Ltda (UK), Kalsec Inc. (USA) e Quest International (Holanda).

Indústria de corantes sintéticos: crescimento anual de 3-5%.
CORANTES NATURAIS
Figura 1
: principais segmentos de mercado para corantes no Brasil em volume em 2007. Fonte: Meinicke, 2008.
CORANTES NATURAIS
BRASIL:


grande mercado;
diversas fontes;
micro-organismos produtores de pigmentos são comuns carotenóides, melaninas, flavinas, quinonas...
tecnologia de cultura de células, processos microbianos e manipulação genética.

BIOCORANTES
Alternativa para corantes artificiais, naturais de plantas, algas e liquens;

Produção de metabólitos: CORANTES naturais;

Ampla aplicação em alimentos no Oriente: angkak ou koji vermelho (
Monascus
);

Europa: caroteno (
Blakeslea
)

BIOCORANTES
Vantagens:

Produção independente de efeitos sazonais e climáticos;

Simples controle de qualidade;

Escala industrial fisiologia, fermentação, engenharia metabólica e tecnologia genética.
BIOCORANTES
Diversas fontes: fungos filamentos e cogumelos

Monascus
spp. laranja, amarelo, vermelho;

Emericella
spp. rosa;

Fusarium
spp. vermelho, laranja.

Figura 2:
comparação de tonalidades geradas por corantes de diversos fungos.

BIOCORANTES
Procedimento básico:

isolar e cultivar o fungo em meio de cultura, temperatura, pH e tempo específicos metabólitos secundários;
fermentação líquida;
filtração;
extração do corante;
concentrar o corante;
purificação;
análise de propriedades bioativas;
testes de qualidade.

CORANTE PRODUZIDO POR
FUSARIUM SPP.
Fungo de interesse:
Fusarium
spp.

ANTRAQUINONAS:
Substâncias fenólicas derivadas da dicetona do antraceno, produzidas pelos fungos: papel similar ao dos corantes naturais extraídos de vegetais
GÊNERO
FUSARIUM
Rápido crescimento;

Colônias com coloração pálida ou colorida, com micélio aéreo ou difuso;

Maioria das espécies: fungos habitantes de solo, com distribuição cosmopolita.
QUINONAS
Benzoquinona, naftoquinona e antraquinona: substâncias orgânicas coloridas e semivoláteis;

antitumorais;
antiinflamatórias;
antifúngicas;
moluscicidas;
tripanocidas;
leishmanicidas;
antiprotozoárias;
Inibidoras da trancriptase reversa do vírus HIV-1.
ANTRAQUINONAS
Formas:

livre sólidos coloridos (amarelos, alaranjados, roxos), pouco solúveis em água e solúveis em solventes apolares;

heterosídeos solúveis em água e álcool e insolúveis em solventes apolares.
Tipos mudando os substituintes nas posições C3 e/ou C6: aglicona, emodina, reina, aloe-emodina.
ANTRAQUINONAS
ANTRAQUINONAS
Aplicações:

fármacos;

alimentos;

cosméticos;

indústria têxtil;

indústria papeleira.

Na indústria alimentícia:

intensificar a cor natural de um produto;

padronizar a aparência e cor de um produto;

restaurar a coloração que, eventualmente, foi perdida durante algum processo industrial;

adicionar um aspecto visual que atraia os consumidores.
OBSTÁCULOS
Tornar corantes naturais solúveis em água:

“com o encapsulamento em bases de amido, gomas e gelatinas, tornando-os uma emulsão. Isso amplia o uso para outros produtos, tendo em vista que a maior parte deles, sobretudo os carotenóides e antraquinonas, são apenas lipossolúveis.” (MEINICKE, 2008)

OBSTÁCULOS
Legislação atual: testes toxicológicos caros;

Custo de processamento;

Aceitação por consumidores: material não conhecido.
Objetivos
O presente estudo teve como objetivo a produção e extração de antraquinonas da biomassa seca de
Fusarium
sp., por solventes orgânicos, para possíveis aplicações biotecnológicas como biocorantes em alimentos.
Objetivos
O presente estudo teve como objetivo a produção e extração de antraquinonas da biomassa seca de
Fusarium
sp., por solventes orgânicos, para possíveis aplicações biotecnológicas como biocorantes em alimentos.
Resultados e Discussão
Conclusão
Referências Bibliográficas
Solubilidade
Utilização da própria biomassa fúngica total como corante em uma simulação de alimento doce;

Parede celular: forma da célula, reprodução, aderência a substratos, (in)compatibilidade com vegetais e proteção.

Aplicação industrial dos biocorantes: grau de solubilidade;

Pigmentos insolúveis: modificações químicas ou utilização de carreadores e estabilizantes;

Pigmentos azafilona primários de
Monascus
(alaranjado) - porção que pode reagir com aminoácidos do meio e formar corantes de vários tons de vermelho (MAPARI et al., 2010);

Schoffelmeer (1999): análise da parede celular
F. oxysporum
, realizou-se o isolamento das estruturas mecanicamente e dissolução completa da parede em soluções a 72% (v/v) e 81% (v/v) de ácido sulfúrico.

Diminuição da densidade da solução de leite condensado (1,30 g/cm3) pela adição de leite (1,028 a 1,034 g/cm3) e água (0,999099 g/cm3 );

Alteração da polaridade pela adição do óleo como um componente apolar;

Após homogeneização, a biomassa tornava a se insolubilizar, formando grânulos precipitados.

Aplicações
Processos industriais alimentícios;

Substituto ao corante natural carmim de cochonilha extraído do inseto
Dactylopius coccus
;

Intensificador de cor para sobremesas;

Aspecto visual diferenciado para produtos direcionados a um público infantil;

Padronizador de cor para bebidas.

Desenvolvimento de um produto
Pigmento roxo na biomassa seca;

Valores nutricionais da proteína de organismo unicelular;

Proteínas de organismos unicelulares: células secas de microorganismos produzidas em grande escala para servir como fonte de proteínas para humanos e animais;

Fusarium graminearum
: fonte de proteína;

Proteínas de organismos unicelulares: alta taxa de crescimento e podem ser cultivadas em meios de cultura alternativos.

Sorvete: exterior grânulos da biomassa seca do Fusarium sp. acompanhados de efeito de “explodir na boca”

Amplo espectro de atividades biológicas;

Enriquecimento proteico;

Cor roxa chamativa;

Cristais de açúcar que “explodem na boca”.
Meio MEA líquido para o cultivo do
Fusarium
sp. obteve maior produção de antraquinona com pigmento roxo;
Não foi possível a sua extração e a solubilização da biomassa;
Presença de outros pigmentos extraídos com álcool etílico e acetato de etila;
Otimização do meio, tempo e as condições de cultivo;
Aperfeiçoamento das metodologias de extração e solubilização.

Enriquecimento do Sorvete
Sorvetes de creme inoculados com
Lactobacillus
;

Probióticos
: microrganismos vivos capazes de melhorar o equilíbrio microbiano intestinal, produzindo efeitos benéficos à saúde;

Concentração adequada destes microrganismos, sendo viável a sua produção.
Casca do maracujá: resíduo industrial;

Pectina: diminuir a concentração de glicose;

Fósforo: fonte de renovação celular;

Cálcio: ossos e dentes;

Ferro: energia e disposição;

Vitamina B3 ajuda a transformar alimentos em energia;

Sorvetes de chocolate e creme com leite bovino e caprino, enriquecidos com farinha de maracujá;

Sorvete de chocolate com leite caprino apresentou maior quantidade de amido, açúcares solúveis e redutores.

Toxicidade
Derivados de antraquinona apresentaram toxicidade mediana em doses acima das aconselhadas, atacando o fígado, os rins e possivelmente hemácias;

Airpink red™: doses recomendadas para uso 100 mg/kg em produtos a base de carne e em bebidas não-alcoólicas, 200 mg/kg em bebidas alcoólicas, 150 mg/kg em produtos que envolvam leite, incluindo sorvetes, e 300 mg/kg em produtos de confeitaria;

Estudos para testar seus efeitos a longo prazo e identificar reações adversas ou reações alérgicas.
Fibra de linhaça, inulina e FOS;

Altos teores de fibra alimentar, cálcio e vitaminas, mas baixos teores de sódio, açúcar e gordura;

Saborizante: polpa de mangaba;

Mangaba: boa digestibilidade, alto valor nutritivo e consideráveis teores de proteína e vitamina C;

Fonte alternativa de nutrientes de produtos lácteos por possuir um sabor exótico.
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Características gerais que influenciam no crescimento e na produção de pigmentos durante a fermentação
Crescimento e Pigmentação
Extração
Solubilidade da biomassa
Composição de meios de cultura e condições de cultivo
Efeito da luz na produção de pigmentos
Extração e estabilidade dos corantes obtidos
1ª Fermentação: 264 horas
3ª Fermentação: 336 horas
6 Erlenmeyers contendo meio 1
6 Erlenmeyers contendo meio 2
2ª Fermentação: 168 horas
10 Erlenmeyers contendo meio 3
10 Erlenmeyers contendo meio 4
10 Erlenmeyers contendo meio MEA
Apesar do volume total de 375 mL produzido durante a fermentação com meio MEA líquido, apenas 0,1482 g de biomassa foram recuperadas após filtração, a qual apresentava coloração roxa.
Síntese de alguns metabólitos secundários por fungos:

estresse fisiológico;

nutrientes disponíveis no meio;

seleção da linhagem fúngica (vias metabólicas);

pH (enzimas e morfologia);

tempo de fermentação e tipo de fermentação.

De acordo com Moritz (2005), a produção de pigmentos depende também da concentração de substrato, indicando que a produção de pigmentos aumenta com o aumento da concentração de glicose inicial no meio de cultivo.

Velmurugan et al. (2010), ao estudar a extração de pigmentos por cinco linhagens de fungos filamentosos, observaram que comparada às outras quatro linhagens,
Fusarium
sp. apresentou baixa produção de pigmentos e biomassa dentre as condições de sua metodologia.
Vermelho/Marrom
Atividades de extrema importância para a sobrevivência e propagação das espécies fúngicas:

crescimento (e sua direção)
produção de pigmentos
reprodução

Portanto, os efeitos desta têm sido investigados entre diversos fungos, e recentemente, com o mapeamento do genoma de várias espécies, foi possível a identificação de genes fotorreceptores (BABITHA
et al
., 2008).
Babitha et al. (2008):
Monascus purpureus
produz mais pigmento quando incubada em ausência total de luz e iluminação favorece o crescimento de biomassa;

Velmurugan et al. (2010): maior produção de pigmentos e biomassa para cinco fungos filamentosos (
F. verticillioides
)

Escuro > luz vermelha > azul claro > branca

Ausência de fotorreceptores;
Baixa acurácia da análise da coloração;
Não houve diferença visivelmente significativa;

Coloração semelhante em culturas que cresceram no escuro e no claro
Biomassa
álcool etílico
acetato de etila
éter
álcool etílico
água
Transparente
Tratamento com solução extremamente básica ou ácida
perda de coloração
Valduga (2005) observou a presença de uma forte associação dos carotenóides com as células de uma linhagem da levedura
Sporidiobolus salmonicolor
(carotenogênese intracelular) e, no sentido de maximizar a extração dos pigmentos, testaram-se diferentes tratamentos de rompimento celular e de extração com solventes, no qual o método com ruptura celular combinando nitrogênio líquido e DMSO, seguido de extração com acetona:metanol (7:3, v/v), foi o tratamento que possibilitou maior recuperação dos carotenóides.
Aguiar (2013) verificou diferentes metodologias para a máxima extração de carotenóides produzidos pela microalga
Dunaliella bardawil
, utilizando solução de acetona 90% e duas condições operacionais, através da extração submetendo ao ultrassom a membrana com as células da microalga e extração com a trituração da membrana, sendo ambas eficientes para o objetivo do estudo e com ausência de diferenças estatísticas entre si.
Variação de cores:

presença de mais de um cromóforo, os quais foram extraídos pela afinidade polar ou apolar de sua estruturação molecular;


Glicosídeos antraquinônicos: Apolares
Agliconas ou Geninas: Polares
Nagia & EL-Mohamedy (2007):

2-acetil-3, 8-dihidroxi-6-metoxiantraquinona, de coloração amarela

2 - (1-hidroxietil) -3,8-di-hidroxi-6-antraquinonametoxi, de coloração laranja
Sensibilidade às mudanças de pH: isomerização
Velmurugan
et al
. (2011) em seus testes de estabilidade do pigmento produzido por
Monascus purpureus
, o qual a cor original foi mantida em pH 5, 6 e 7.
Em condições ácidas (pH 1~4), o pigmento perdeu a sua cor, formando precipitados na parte inferior dos tubos, e em condições alcalinas (pH 8~14), apresentou alteração em sua cor.
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