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Inmovilización de Enzimas: Pectinasa sobre Alginato.

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Laura Landazábal

on 20 June 2013

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Transcript of Inmovilización de Enzimas: Pectinasa sobre Alginato.

Laura Natalia Landazábal González
Stephanie Segura Cano

INMOVILIZACIÓN DE PECTINASA EN GEL DE ALGINATO DE SODIO: COMPARACIÓN DE CONDICIONES DE REACCIÓN ÓPTIMAS Y CINÉTICA DE LA REACCIÓN ENTRE LA ENZIMA LIBRE Y LA ENZIMA INMOVILIZADA
CONTENIDO
Objetivos
Introducción
Metodología
Resultados y discusión
Conclusiones
Bibliografía

METODOLOGÍA
INTRODUCCIÓN
OBJETIVOS
Inmovilizar una enzima (Pectinasa) mediante atrapamiento, en una matriz porosa (Alginato de Sodio)
Determinar las condiciones óptimas de pH, concentración de enzima, temperatura y tiempo de incubación para la reacción de hidrólisis de pectina con la enzima pectinasa, inmovilizada y sin inmovilizar.
Determinar los parámetros cinéticos (Km y Vm) de la reacción de hidrólisis de pectina con pectinasa sin inmovilizar e inmovilizada, mediante el método de velocidades iniciales.
INMOVILIZACIÓN ENZIMÁTICA
PECTINA
Fig. 1 Fragmento de Pectina.
La pectina son heteropolicarbohidratos muy complejos, compuestos principalmente por ácido galacturonico, un carbohidrato derivado del ácido uronico, unido por enlaces alfa-1-4 glicosídicos. Esta biomolécula se encuentra mayoritariamente en la pared celular de una gran variedad frutas. [1]
[1] Rehman, H. U., Aman, A., Silipo A., Qader A. A. U., Molinaro A., Ansari A. Degradation of complex carhobydrate: Immobilization of pectinase from Baccillus Licheniformis KIBEG-IB21 using Calcium Alginate as support. Food Chemestry. 139 (2013) 1081-1086
[2] Li T., Wang N., Li S., Zhao Q., Guo M., Zhang C. Optimization of covalent immobilization of pectinase on sodium alginate support. Biotechnol Lett. 29 (2007). 1413-1416.
[3] Rios L., Arias F., Inmovilización de Pectinasas y/o Celulasas y determinación de algunos de sus efectos en el jugo de guayaba. Trabajo de Grado para optar al título de Ingeniero Químico. Universidad Nacional de Colombia. 2002.
La ruptura hidrolítica conlleva a la disminución de la viscosidad de extractos de pectina, responsable, por ejemplo, de la turbides en jugos frutales. De allí su uso como clarificante de jugos frutales, vegetales, y vinos [3]
Es el termino genérico, por el cual se hace referencia a un grupo complejo de enzimas que actúan sobre la Pectina [2]. Este grupo heterogéneo se divide en enzimas depolimerizadoras o enzimas saponificadores o pecti-estereasas. [3]
PECTINASA
Fig. 2 Acción de las depolimerasas [3]
Fig. 3 Acción de las pectinestereasas [3]
Fig. 4 Diferentes tipos de depolimerasas [3]
BILBIOGRAFÍA
Métodos de Cuantificación
Inmovilización de la enzima
Determinación del pH de máxima actividad enzimática
Determinación del tiempo de incubación de mayor actividad enzimática
Determinación de la temperatura de mayor actividad enzimática
Determinación del efecto de la concentración de enzima
Se emplea un método de cuantificación de proteínas para cuantificar la enzima, y uno de azúcares reductores para cuantificar los productos de reacción.
Cuantificación de enzima por U.V
Método de DNS
[4] López M. E., Anzola C., Guía de laboratorio de bioquímica para la carrera de química. Universidad Nacional de Colombia, Bogotá, Facultad de Ciencias, Departamento de Química. 1ra Edición (2003). pp. 130-131 y 136.
Se elabora una curva de calibración con un patrón de Pectinasa 5mg/mL. Se mide la absorvancia de las aguas del labado y se cuentifica cuanta enzima se inmovilizó.
Se adicionan, agitando, todos los reactivos, se dejan en reposo durante 10 minutos a 37°C y se lee la absorbancia a 540nm.
Se elabora una curva de calibración con patrón de ácido d-galacturónico de 5mg/ml. Para cuantificar el porducto de la reacción enzimática.
Se adicionan, agitando, todos los reactivos. Luego se llevan a un baño en ebullición durante 5 minutos. Se dejan enfriar y se lee su absorbancia a 540nm.
[5] Martínez Yepes, Pedro Nel. EXPERIMENTOS DE QUIMICA ORGANICA, CON ENFOQUE EN CIENCIAS DE LA VIDA. ELIZCOM S.A.S. 2009. pp 158-160.
Se mezclaron 10mL de alginato de sodio al 3,0%p/v preparados en buffer de acetatos (0.05M pH 4) con 10 mL de solución de Pectinasa 6.0mg/mL en el mismo buffer para formar la solución A. La solución A fue agregada gota a gota sobre 30mL de CaCl2 al 1,0M en agua, con agitación constante a temperatura ambiente para lograr la formación de esferas. Las esferas se dejaron en la solución por 15 minutos con agitación constante y a temperatura ambiente, se filtraron y se lavaron con agua destilada dos veces. Las aguas del filtrado, tanto como las de los lavados fueron analizadas por espectroscopía U.V. La enzima atrapada se cuantificó restando la cantidad de enzima presente en las aguas de filtrado y lavado a la cantidad de enzima agregada inicialmente.
Se adicionan, agitando la mezcla y en baño a 37°C, todos los reactivos excepto la enzima. Se adiciona la enzima y 10 minutos después se agrega el reactivo de DNS y el NaOH. Se cuantifica el producto de reacción mediante el método DNS. El reactivo de DNS también sirve como inhibidor de la reacción. Al agregarlo, este la detiene. El patrón empleado es de Pectinasa 0,5mg/mL.
Se adicionan, agitando la mezcla y en baño a 37°C, todos los reactivos a pH 4,0 excepto la enzima. Se adiciona la enzima y luego, dependiendo del tiempo de reacción, se agrega el reactivo de DNS y el NaOH para detener la reacción. Se cuantifica el producto de reacción mediante el método DNS. El patrón empleado es de Pectinasa 0,5mg/mL.
Se adicionan, agitando la mezcla, todos los reactivos excepto la enzima. Se lleva cada mezcla al baño correspondiente, se ajusta el pH a 4,0 y se deja en reposo durante 10 minutos, se adiciona la enzima y se deja reaccionar durante 10 minutos. Al finalizar dicho tiempo se agrega el reactivo de DNS y el NaOH para detener la reacción. Se cuantifica el producto de reacción mediante el método DNS. El patrón empleado es de Pectinasa 0,5mg/mL.
[1]
[1] Rehman, H. U., Aman, A., Silipo A., Qader A. A. U., Molinaro A., Ansari A. Degradation of complex carhobydrate: Immobilization of pectinase from Baccillus Licheniformis KIBEG-IB21 using Calcium Alginate as support. Food Chemestry. 139 (2013) 1081-1086
[2] Li T., Wang N., Li S., Zhao Q., Guo M., Zhang C. Optimization of covalent immobilization of pectinase on sodium alginate support. Biotechnol Lett. 29 (2007). 1413-1416.
[3] Rios L., Arias F., Inmovilización de Pectinasas y/o Celulasas y determinación de algunos de sus efectos en el jugo de guayaba. Trabajo de Grado para optar al título de Ingeniero Químico. Universidad Nacional de Colombia. 2002.
[4] López M. E., Anzola C., Guía de laboratorio de bioquímica para la carrera de química. Universidad Nacional de Colombia, Bogotá, Facultad de Ciencias, Departamento de Química. 1ra Edición (2003). pp. 130-131 y 136.
[5] Martínez Yepes, Pedro Nel. EXPERIMENTOS DE QUIMICA ORGANICA, CON ENFOQUE EN CIENCIAS DE LA VIDA. ELIZCOM S.A.S. 2009. pp 158-160.
[6] Arroyo, Miguel, Inmovilización de enzimas. Fundamentos, métodos y aplicaciones., Ars Pharmaceutica, 39:2; 23-39, 1998.
[7} 2.Wang S. N., Enzyme Inmovilization Protocol: Entrapment in Alginate Gel, Department of Chemical & Biomolecular Engineering, University of Maryland.
[8] Bohinski R. C. Bioquímica, 5°Ed, Pearsons Education, 1991.
[1]
[1]
[1]
[1]
Determinación de los parámetros cinéticos de la hidrólisis
[5]
Se adicionan, agitando la mezcla, todos los reactivos excepto la enzima. Se lleva cada mezcla al baño a 37°C y pH 4,0 se adiciona la enzima y se deja reaccionar durante 10 minutos. Al finalizar dicho tiempo se agrega el reactivo de DNS para detener la reacción. Se cuantifica el producto de reacción mediante el método DNS. El patrón empleado es de Pectinasa 0,5mg/mL.
MÉTODOS DE INMOVILIZACIÓN
Por adsorción
Por enlace covalente
Por atrapamiento
Por encapsulación
Por reticulación
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Einmovilizada = EAñadida – ENo imovilizada
Donde:
EAñadida = Conc. Enzima * Volumen solución A
= 6,0mg/mL*20mL
=120,0mg
ENo Inmovilizada = Conc. Enzima * Volumen Aguas filtrado
Conc. Enzima = [Abs Aguas Filtrado + 0,015Abs]/0,421Abs/(mg/mL) = 0,96mg/mL
Entonces
ENo Inmovilizada = 0,96mg/mL*40mL
=38,3mg
Lo que nos lleva a que:
Einmovilizada= =81,7mg ;
%Inmovilización = 68,1

CUANTIFICACIÓNES
Enzima
Ácido d-galacturónico
PARÁMETROS ÓPTIMOS
PARÁMETROS ÓPTIMOS
PARÁMETROS ÓPTIMOS
ESTUDIO CINÉTICO
Efecto de la concentración de enzima
Efecto del pH
Efecto del tiempo
Efecto de la temperatura
CONCLUSIONES
El porcentaje de inmovilización de la pectina en gel de alginato fue de 68,1%.

La inmovilización cambia las condiciones de reacción enzimática. Este cambio de condiciones puede ser favorable, pues la enzima puede ganar en resistencia a la desnaturalización [1,2,3,,6,7], pero perder en actividad catalítica (gráficas 4, 5, 6 y 7)

La ventaja de la inmovilización es que aumenta su resistencia a la desnaturalización haciendo que su uso y aplicación se extiendan, especialmente a niveles industriales.

El pH afecta estado iónico de la enzima, influyendo directamente en los grupos ácidos y básicos provenientes de los aminoácidos que constituyen la proteína: esto conlleva a un cambio en el estado físico-químico de los complejos enzima/sustrato y enzima/producto, por lo que condiciona de manera determinante la catálisis ácido/base. [8]
El pH óptimo de la pectinasa libre fue de 3.5 valor que no concuerda, pero es cercano, a los reportados en literatura 4,0 para [1] y [2] y 3,0 para [7].
A mayores tiempos de incubación, el % de hidrólisis llegará a un valor constante. Por ello, se determinó que un tiempo óptimo de reacción es de 10 minutos, pues a ese tiempo se ha obtenido un porcentaje casi constante de conversión y además, se disminuyen los riesgos de desnaturalización o contaminación de la enzima, favoreciendo la reacción.
La actividad de la enzima por efectos de cambios en su conformación conocidos como desnaturalización. La inmovilización enzimática genera perdida de la actividad por impedimentos en la formación del complejo enzima-sustrato, pero con un aumento de la estabilidad de la enzima por resistencia a la desnaturalización [1], [2], [6]
La enzima inmovilizada tiene menor afinidad por el sustrato que la enzima libre, y esto se ve a través de Km. Esto se debe a factores estéricos y conformacionales que afectan el acceso y/o la forma del sitio activo. También, hay una disminución de la velocidad máxima en la enzima inmovilizada respecto a la libre por razones similares
El patrón empleado es de Pectinasa 0,5mg/mL.
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