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Extracción de ADN Fenol-Cloroformo, Salting Out

Bases fisicoquímicas para la extracción de ácidos nucléicos
by

David Cruz

on 1 February 2014

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Transcript of Extracción de ADN Fenol-Cloroformo, Salting Out

Extracción de ADN por Fenol-Cloroformo y Salting Out
Yo
Fenol-Cloroformo
(Reactivos)
Fenol: Viene enlazado al buffer Tris. Solución Tris-fenol 50%, Cloroformo 50%, por lo general. El buffer es necesario para que el ácido nucléico se mantenga en la parte acuosa una solución posterior
Cloroformo. Se estabiliza con amylene o etanol, ya que su exposición en estado puro al oxígeno o a la luz UV produce gas fosgeno
Isoamyl: Se adiciona para controlar la formación de espuma (?)
Factores Experimentales a tener en cuenta
1
pH
a) Enlaces de Hidrógeno entre hebras: pH 4-10
b) Enlaces fosfodiester: pH 3-12
c) Enlaces entre N-glycoside y purinas: pH > 3
2
Temperatura
ADN comienza a desnaturalizarse
entre 80 y 90°C
3
Salinidad
El ADN es más estable en soluciones salinas. Concentraciones de sal de menos de 1m debilitan sus puentes de hidrógeno
4
Condiciones Celulares
En algunas células (levadura), romper la pared celular requiere un tratamiento especial (¿sonido?). En otras se puede hacer lisis con una enzima (lysozyme)
Varias enzimas en la célula pueden degradar el ADN. Sobre todo ADNasas, que catalizan hidrólisis de los enlaces fosfodiéster
Histonas deben desasociarse durante el proceso
Procedimiento General
Paso 1: Romper la membrana celular y liberar el ADN en un medio en el que sea soluble y esté protegido
Romper la pared Celular
Uso de lysozymas para degradar enlaces glicosídicos en la misma
Medio
Solución salina: El ADN más estable con altas concentraciones de sal, dado su carácter iónico.
EDTA
Se enlaza con iones metálicos divalentes, que podrían reaccionar con los fosfatos del ADn para formar sales
Al enlazarse a Mg 2+ o a Mn 21, inhibe la acción de ADNasas que necesitan estos átomos para funcionar
Paso 2: Disociar complejos ADN-proteínas
Interacciones ADN- Histonas, se deben a la carga negativa del ADN y la positiva de las proteínas.
Detergentes: Transmiten su carácter aniónico a las proteínas
pH alcalino merma el carácter iónico de las histonas
Altas concentraciones de sal, que ayudan a disminuir la atracción entre ambos iones.
Paso 3: Separar el ADN de otros componentes Celulares Solubles
Solución debe ser desproteinizada. Se agrega isoamyl-cloroformo y se centrifuga: Se producen tres fases.
Fase Acuosa Superior (ADN, ARN y algunos contaminantes)
Interfase (Concentración de proteínas desnaturalizadas)
Fase Orgánica Inferior
Se separa la fase acuosa, se agrega etanol y el ADN se precipita. Para "limpiarlo" completamente, se repite el proceso de disolverlo y agregar cloroformo.
+ etanol
Salting Out
Una concentración de sal específica hará que una proteína se precipite, dependiendo de la cantidad de aminoácidos hidrofóbicos e hidrofílicos que tenga.
Enlace de Aminoácidos hidrofílicos con H2O, se hace más difícil entre más átomos de sal haya para que se unan al agua.
La proteína se enlazará con ella misma, creando un enlace hidrofóbico, y se precipitará.
Si los aminoácido hidrofílicos logran enlazarse a cierta cantidad de moléculas de agua, la proteína se disolverá.
Bibliografía

Washington School of Medicine, Department of Human Genetics: Method: Salting Out Procedure for Human DNA Extraction, C Helms, 1990
http://humgen.wustl.edu/hdk_lab_manual/dna/dna2.html

University Of Regina: Phenol-Chloroform extraction
http://uregina.ca/~ngdann/Bioc422/proj1.htm
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