Loading presentation...

Present Remotely

Send the link below via email or IM

Copy

Present to your audience

Start remote presentation

  • Invited audience members will follow you as you navigate and present
  • People invited to a presentation do not need a Prezi account
  • This link expires 10 minutes after you close the presentation
  • A maximum of 30 users can follow your presentation
  • Learn more about this feature in our knowledge base article

Do you really want to delete this prezi?

Neither you, nor the coeditors you shared it with will be able to recover it again.

DeleteCancel

Make your likes visible on Facebook?

Connect your Facebook account to Prezi and let your likes appear on your timeline.
You can change this under Settings & Account at any time.

No, thanks

Untitled Prezi

No description
by

hajer abdennebi

on 26 June 2013

Comments (0)

Please log in to add your comment.

Report abuse

Transcript of Untitled Prezi

L'étude des gènes de grandes tailles
Technique de choix pour le balayage des mutations
Rapide
Sensibilitée élevée
Apport de la DHPLC dans l'étude génotypique de la mucoviscidose
La mucoviscidose
Introduction
Pathologie pédiatrique, héréditaire et génétique à transmission autosomique récessive.

Due à l'altération du gène CFTR codant pour une protéine transmembranaire appelée CFTR, qui assure la régulation des flux hydro-éléctrolitiques à l'intérieur de l'organisme.

en absence de cette protéine:
sueur anormalement salée
sécrétions muqueuses trop épaisses
Aspects cliniques
Se manifeste souvent dès l'enfance ou la naissance.
La sévérité varie selon la mutation du gène CFTR ou selon d'autres facteurs génétiques et environnementaux.
manifestations pulmonaires
dégradation progressive de l'état respiratoire:
toux chronique
épisodes répétitifs de bronchites

manifestations digestives
Occlusion intestinale, syndrome de l'occlusion intestinale distale(SOID).
élévation de la viscosité de la bile.
insuffisance pancréatique
diarrhée chronique.


Autres manifestations
stérilité chez l'homme
déshydratation due à la perte de sel sinusite chronique, perte de l'odorat et migraines.
structure du gène CFTR
Protéine CFTR
mutations mucoviscidosiques
Corrélation génotype et phénotype
génétique de la mucoviscidose
Le gène CFTR, dont les mutations sont responsables de la maladie de la
mucoviscidose, est localisé sur le chromosome 7 au locus q31, (7q31.2)
Il fait 190 kb et contient 27 exons.
L’ARNm de 6.5 kb est traduit en une protéine transmembranaire
composée de 1480 acides aminés appelée CFTR


La protéine joue le role de canal transmembranaire pour les cellules épithéliales.
Elle assure l'échange des ions chlorure selon un gradient électrochimique.
42% mutations faux-sens
24% microinsertions et microdélétions
16% mutations non-sens
2% de délétions d'un acide aminé
16% mutations d'épissage
1939 mutations répertoriées
Les mutations sont réparties en six groupes selon les atteintes fonctiennelles et structurales de la protéine.
associée à une forme modérée de la mucoviscidose
observée chez des patients adultes
mutation modérée


mutation modérée
mutation très modérée
mutation sévère
mutation sévère
observée chez des patients adultes
le cas de mucoviscidose avec insuffisance pancréatique
Diagnostic de la mucoviscidose
Diagnostic biochimique
Diagnostic génotypique
Test de la sueur
Mesure de la différence de potentiel nasal(DDP)
Technique de balayage
Réaction de séquençage
Recherche des mutations les plus fréquentes
Si le génotype est incomplet
confirmer l'anomalie moléculaire
DHPLC
Chromatographie liquide à haute perfomance en conditions dénaturantes.
Permet de détecter les substitutions de bases, petites délétions ou insertions.
Matériel et Méthodes
I-Patients étudiés
19 patients étudiés.
45 jours < âge < 17 ans
symptomatologie évocatrice.
Test de la sueur positif.
Analyse moléculaire pratiquée pour identifier les mutations en cause au niveau du gène CFTR
Six exons analysés: exon 5, 11, 17b, 19, 20 et 21.

II- DHPLC
PCR: amplification des allèles normaux et mutés
Dénaturation par chauffage
Refroidissement lent: formation des homoduplexes et des hétéroduplexes
normal mutant
hétéroduplexes homoduplexes
colonne DHPLC
Injection des échantillons dans un flux contenant TEAA et de l'ACN
L'ADN chargé négativement interagit avec le TEAA lié aux billes

colonne placée dans un four: 55-65°C
ADN partiellement dénaturé par la chaleur
Un flux d'ACN de concentration croissante diminue l'interaction ADN-TEAA
Les hétéroduplexes, moins affins pour le TEAA,sont élués en premier
La concentration d'ACN augmente.. et las homoduplexes décrochent
Les homoduplexes sont élués en second
Détection en sortie de colonne par mesure de l'absorbance à 260nm
Hétéroduplexes Homoduplexes
Etude phénotypique
Âge
Moyenne d'âge est de 8 ans et demi
Répartition géographique
selon la région
37%
5.5%
10.5%
5.5%
5.5%
Consanguinité
Aspects cliniques
Notée chez 19 familles
Augmente la fréquence des homozygotes
Incidence de la mucoviscidose augmente
Etude biochimique
Test de la sueur selon la méthode semi-quantitative l'Exudose.
Les valeurs varient entre 63.3 et 106mmol/l avec une moyenne de 79.2mmol/l.
Taux de concentration augmente avec l'âge
Étude moléculaire
Etude de l'exon 10
Étude de l'exon 11
Etude de l'exon 17b
Étude de l'exon 21
Étude des exons 5,19 et 20
Chromatogramme correspondant à la mutation F508del
Chromatogramme de l'exon 11
Profil de séquencage du brin direct de la mutation G542X à l'etat hétérozygote
Chromatogramme de l'exon 17b
Profil de séquencage du brin réverse de la mutation E1104X à l'état hétérozygote
Chromatogramme de l'exon 21
Profil de séquencage du brin direct de la mutation N1303K à l'état hétérozygote
Aucun profil différent du celui du témoin normal
Pour l'exon 19, aucune mutation fréquente identifiée
dans notre population
Aucun témoin hétérozygote n'a été utilisé
Chromatogramme de l'exon 19
Les différentes génotypes identifiées chez les 19 malades analysés
Résultats et discussion
Les glandes sudoripares ont une teneur augmentée en ions Na+ K+ et Cl-.
La concentration des chlorures est testée selon trois étapes:
stimulation des glandes sudoripares.
recueil de la sueur
dosage des ions chlorures
concetration des chlorures 60mmol/l
diagnostic confirmé
concentration des chlorures 40mmol/l
valeurs normales

Dans une colonne chromatographique, les molécules d'ADN sont séparées en combinant les effets de la température et des tampons.
Conditions non dénaturantes
40°C<T°<50°C
Conditions semi dénturantes
50°C<T°<70°C
Conditions totalement dénaturantes
70°C<T°<100°C
Epidémiologie

Très fréquente dans la
population européenne.







Très rare chez les sujets africains et asiatiques.
1 mois-1an
1 an-5 ans
>5ans
Atteinte respiratoire
Atteinte digestive
Atteinte respiratoire et digestive
Témoin normal
Témoin hétérozygote pour la mutation N1303K
Malade hétérozygote pour la mutation N1303K
Malade E1104X/E1104X
Malade hétérozygote pour la muatation E1104X
Témoin hétérozygote pour la mutation E1104X
Témoin normal
Malade homozygote+ témoin normal
F508del

47.36%
E1104X

21.05%
G542X

5.26%
N1303K

5.26%
Les différentes mutations identifiées
Résultats obtenus dans une étude ultérieure avec 68 patients mucoviscidosiques
Fréquence élevée des génotypes à l'état homozygotes
la fréquence de la consanguinité de notre étude et méme de notre pays est élevée
Témoin normal
Témoin normal pour l'exon 19
Témoin normal pour l'exon 19
Réactifs de la DHPLC
Tampon A
TriEthyl Ammonium Acétate (TEAA)
Tampon B
TEAA 75%
Acétonitrile (ACN) 25%
Tampon D
TEAA 25%
ACN 75%
DHPLC
Phase stationnaire
Phase mobile
Touche environ
1/2500
naissance
1/25
personne est hétérozygote

Le risque de transmmission dans une famille ayant un enfant atteint est
1/4
Phase stationnaire
Tampon A+ polystyrène divinilbenzène (PS-DVB)
Tampon A+ Tampon B
Plan
Introduction
Etude bibliographique
Matériel et méthodes
Résultats et discussion
Conclusion

Les températures de dénaturation choisies pour chaque exon
L'analyse de la mutation F508del s'effectue dans des conditions non dénaturantes:
en mode sizing
Conclusion
Phase mobile
la mucoviscidose est une maladie héréditaire autosomique récéssive fréquemment fatale et sous diagnostiquée dans notre population.

la DHPLC s'est avérée l'une des techniques les plus fiables pour établir le profil de distribution des mutations chez les patients.
Ces données vont nous permettre de:
Affiner le conseil génétique.
Améliorer la spécificité du diagnostic prénatal.
Choix d'une thérapie spécifique.



Ne détecte que des mutations à l'état hétérozygote
DHPLC
Séquençage
n: nombres des malades
Objectif
Utilisations de nucléotides, didésoxyribonucléosides triphosphates ddNTPs pour la polymérisation du brin.
Blocage de polymérisation fragments de tailles différentes marquées à leurs extrémités.
Migration sur séquenceur automatique par éléctrophorèse capillaire.
Laser pour exciter les fragments fluorescents.
Données de migration transformées en éléctrophorégrammes (pics de couleurs correspondant à la séquence nucléotidique).

Identification des mutations par la technique de DHPLC
Déterminer le de la DHPLC dans cette étude
rôle
Merci

pour votre

attention
Full transcript