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Avaliação biológica in vitro BC e LG - Defesa

Apresentação da dissertação final
by

Kátia Mayumi

on 3 July 2014

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Transcript of Avaliação biológica in vitro BC e LG - Defesa

Avaliação biológica
in vitro
de espécies vegetais da caatinga
Bauhinia cheilantha
e
Lippia gracilis
UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALAGOAS
ESCOLA DE ENFERMAGEM E FARMÁCIA
PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM ENFERMAGEM

Defesa
20/02/2014
KÁTIA MAYUMI TAKARABE CAFFARO

MACEIÓ
2014
Orientadora: Profª Drª Maria Lysete de Assis Bastos
Co-orientadora: Profª Drª Eliane Aparecida Campesatto

Importância das plantas medicinais



Biodiversidade brasileira



Iniciativas governamentais relacionadas às plantas medicinais



O bioma Caatinga




INTRODUÇÃO

Abordagem etnodirigida como ponto de partida para estudos farmacológicos



Seleção das espécies estudadas e delineamento dos ensaios biológicos



A interface da enfermagem na pesquisa básica experimental
2006
2009
CAATINGA
Estação chuvosa
Estação seca
Objetivos
Estudo experimental delineado nos moldes de pesquisa quantitativa, realizado nos laboratórios LpTF (ESENFAR), LPqPN e LPqRN (IQB).



Avaliar a atividade biológica
in vitro
de extratos etanólicos das espécies vegetais
Bauhinia cheilantha
e
Lippia gracilis
.

Avaliar a atividade antibacteriana e antifúngica;
Determinar a atividade antioxidante;
Realizar a prospecção fitoquímica.


Preparo dos extratos brutos: partes utilizadas, secagem, trituração, maceração com etanol, remaceração, filtração, destilação.


folhas, casca do caule e caule; partes aéreas e caule
Avaliação da atividade antimicrobiana
Cepas microbianas ATCC®
Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Klebisiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa
e
Candida albicans
Padronização da densidade do inóculo - tubo 0,5 da escala de Mc Farland (CLSI)



Técnica de difusão em meio sólido a partir de orifício (AYRES, 2008; LIMA, 2006)




Microdiluição em caldo para a determinação da CIM (AYRES, 2008)


Incubação a 35ºC por 24h e 48h

Avaliação da atividade antioxidante
CSR: capacidade sequestradora de radicais livres utilizando o radical sintético estável DPPH: DPPH• + AH ↔ DPPH-H + A•




Ensaio qualitativo: (+)-catequina (SOLER-RIVAS, 2000)



Ensaio quantitativo: ácido ascórbico e o BHT (GOVIDARAJAN, 2003)
Solubilização dos extratos em MEOH [200, 150, 100, 50 e 25 microgramas/mL]
Leitura da absorbância de cada [] contra o MeOH espectroscópico durante 60'
Cl50 = [amostra] necessária para reduzir em 50% a [DPPH inicial]
Considerações finais e perspectivas
Atividade antimicrobiana dos extratos etanólicos de
Bauhinia cheilantha
, avaliados através da difusão em meio sólido e microdiluição
Avaliação da atividade dos extratos etanólicos
Bauhinia cheilantha
e
Lippia gracilis
, frente ao radical DPPH.
* Único bioma exclusivamente brasileiro e principal ecossistema região nordeste
* Terapêutica de espécies vegetais semiáridas: parte da cultura de muitas gerações
* Estudos etnodirigidos
* Potencial de bioprospecção

Plantas com adaptações únicas diante das condições ecológicas locais de uma vegetação peculia
r.
Reconhecimento, valorização e preservação do conhecimento tradicional das comunidades, quanto à suas práticas populares de uso de plantas medicinais
Método de abordagem etnofarmacológica: maior probabilidade de descoberta de novas substâncias bioativas.
* Estudo pioneiro em Piranhas e Delmiro Gouveia: 187 plantas medicinais (ALMEIDA, 2006)
* Ponto de partida do estudo
* Espécies endêmicas e com gêneros presentes na RENISUS

Bauhinia cheilantha (mororó)
Lippia gracilis (alecrim-de-chapada)
* Bauhinia: 300 espécies - folhas, casca do caule e caule - uso popular para diversos fins
* Potencial antimicrobiano de espécies do gênero
* Potencial antioxidante: relação efeito hipoglicemiante (estado hiperglicêmico produção de ROS)
* BC: flavonóides e taninos


* Lippia: 200 espécies - folhas e flores
* Uso popular para diversos fins e estudos comprovados de seus óleos essenciais
* Potencial antioxidante de espécies do gênero
* Potencial antimicrobiano comprovado de óleos essenciais e compostos fenólicos de LG
* Investigação de metabólitos secundários não voláteis

* Enfermeiro: facilitador do processo do cuidado;
* Envolvimento da enfermagem na consolidação dos objetivos de importantes iniciativas governamentais;
* Estudos etnodirigidos em USF/UBS destacam a importância da comprovação farmacológica do uso popular;
* Atuação na pesquisa básica: integração com outras disciplinas e intersecção com a assistência.
2012
BC-F
BC-CC
BC-C
LG-PA
LG-C
Atividade antimicrobiana dos extratos etanólicos de
Lippia gracilis
, avaliados através da difusão em meio sólido e microdiluição
1,0 mg/mL
0,5 mg/mL
0,25 mg/mL
0,125 mg/mL
0,0625 mg/mL
0,03125 mg/mL
C-
C+
1
2
3
4
5
6
7
8
9
A

B

C

D

E

F

G

H
CE
10
11
12
0,015625 mg/mL
Bauhinia cheilantha
C+
CSR: +
Bauhinia cheilantha
Avaliação antimicrobiana
Avaliação antioxidante
Lippia gracilis
: potencial antimicrobiano e evidenciando de presença de constituintes bioativos fixos - compostos fenólicos
Bauhinia cheilantha
: potencial antioxidante das partes avaliadas - flavonoides
Primeiro relatório a respeito da atividade antimicrobiana e antioxidante de extratos brutos de
Lippia gracilis
e
Bauhinia cheilantha
;
Avaliação da toxicidade - LaFI;
Identificação e quantificação das classes de compostos - Profº Luiz Caetano (University of London);
Resultados suportam (parcialmente) o uso popular de ambas as espécies - relação do saber popular e busca na comprovação científica.
>16mm
13-15mm
<12mm

(ALMEIDA, 2011)
Aplicação de alíquotas de 2 microlitros das 5 amostras e eluição em sistemas de solventes adequados


Solução metanólica [0,4mM]
CSR +
15 a 20% do total mundial: patrimônio potencialmente capaz de render-lhe grandes benefícios econômicos
PLANTAS MEDICINAIS
* 80': resgate pela opção terapêutica com produtos naturais
* 90': diretrizes OMS - aumento significativo interesse global pelas plantas medicinais e fitoterápicos


Kumar (2005): Extrato metanólico da casca do caule de
B. racemosa
apresentou CI50 152,29 microg/mL (DPPH) - resultado estatisticamente significativo fortalecendo a possibilidade do potencial de BC;
Sowndhararajan (2013): Extratos brutos de folhas
B. vahlii
apresentaram CI50 < 80 microg/mL (DPPH);
Argolo (2004): Extratos de folhas de
B. monadra
demonstraram potencial antioxidante comparado com catequina (DPPH) - esteroides e flavonoides;
Estudos com outros métodos também comprovaram potencial antioxidante de espécies de
Bauhinia;
Flavonoides: grupos de compostos fenolicos que têm potencial antioxidante
Sarrazin (2012): valores de 1,0 mg/mL consistentes com os resultados desse estudo para as mesmas cepas testadas com óleo essencial de
L. grandis
;
Botelho (2007): Óleo essencial de
L. sidoides
apresentou CIM 2,5 mg/mL e composto fenólicos carvacrol e timol apresentaram CIM 1,25 e 0,625 mg/mL contra
Candida albicans
;
Presença de compostos fenólicos dos constituintes fixos.
Sarrazin (2012): Óleo essencial de
L. grandis
inibiu todas cepas G+ testadas e
P. aeruginosa
e
C. albicans
foram resistentes (possível presença de constituintes não voláteis);
Botelho (2007) e Oliveira (2007): Óleos essenciais de
L. origanoides
e
L. sidoides
inibiu
C. albicans
.



Lippia gracilis
Mishra (2011): Extratos benzênicos de folhas de
B. variegata
inibiram crescimento de
S. aureus
- 10 mm e 60 mg/mL
Martínez (2011): Ext. etanólicos e frações de folhas de
B. variegata
demonstraram CIM > 1,0 mg/mL
Kumar (2005): Ext. metanólicos da casca do caule de
B. racemosa
apresentou CIM 0,025 a 0,2 mg/mL
Dugasani (2010): Extratos brutos de raízes de
B. tomentosa
e
B. vahlii
apresentaram CIM de 0,0625 e 0,250 mg/mL - presença de flavonóides e taninos
Atividade antimicrobiana na casca do caule e raíz maiores que nas folhas de espécies do gênero
resistência de cepas G-
* Controles:
C- DMSO ou Cremophor a 10%
C+: Ceftriaxona, Ciprofloxacina e Fluconazol (CLSI, 2012)
* TRIPLICATA
* Diâmetros 7 mm
* 10 mL Agar/placa
* Extrato a 10% - 50 microlitros/poço

Muito obrigada!

mayumikatia@gmail.com

Prospecção fitoquímica
Identificação das classes de constituintes químicos presentes nos cinco extratos etanólicos;
Protocolo descrito por Matos (1997);
Metodologia com abordagem qualitativa;
Alíquotas de 1mg/mL de cada extrato.


Resultado da prospecção fitoquímica
B. manca, B. candicans, B. uruguayensis, B. purpurea, B. forficata
e
B. splendens;
Predominância de alcaloides, terpenos, esteroides e especialmente flavonoides;
B. cheilantha
(folhas): flavonoides, taninos e antraquinonas (SILVA, 2007)
Resultados x literatura
Ênfase nos constituintes voláteis;
Flavonoides em
L. citriodora
e
L. nodiflora
;
Taninos, triterpenos e esteroides em
L. alba
;
Alcaloides em
L. dulcis, L. germinata, L. nodiflora
e
L. turbinata
;
Saponinas e antronas nas partes aéreas de LG.
LEITURA: 20 microlitros TTC a 0,5% e reincubação por 3h
* Cor vermelha: crescimento microbiano
* Ausência: ação inibitória do EB
CIM = menor concentração do extrato capaz de inibir completamento o crescimento microbiano


A: 200 microlitros do extrato
B-H: 100 microlitros caldo Muller Hinton (2x)
Transferência 100 microlitros do extrato até H
Incubação a 35ºC por 18h / TRIPLICATA


* Análise por Microcal Origin 6.0®
* %DPPH remanescente no meio reacional foi obtida a partir da equação matemática da curva de calibração e dos valores de absorbância após 60'
* TRIPLICATA

Partes aéreas: possibilidade da existência de constituintes bioativos;
Damasceno (2008): Extratos metanólicos das partes aéreas de
L. grandis
apresentaram CI50 20,1 - compostos fenólicos;
Alves (2010): Óleos essenciais de
L. gracilis
> potencial antioxidante do que
L. sidoides
;
Almeida (2010): Extratos etanólicos e compostos isolados de folhas de
L. sidoides
- substâncias flavonoídicas;
Óleo essencial de
L. gracilis
é rico em compostos fenólicos como o timol e carvacrol, potentes antioxidantes - importância na investigação dos constituintes fixos.
Lippia gracilis
Profª Lysete Bastos e LpTF
Profª Eliane Campesatto e LaFI
Docentes e colegas do PPGENF
Professores e doutorandos do LpTF e LpQPN
Profº Luiz Caetano e pós-doutoranda Adriana Todaro
Bolsa da CAPES / FAPEAL
Agradecimentos...
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