Loading presentation...

Present Remotely

Send the link below via email or IM

Copy

Present to your audience

Start remote presentation

  • Invited audience members will follow you as you navigate and present
  • People invited to a presentation do not need a Prezi account
  • This link expires 10 minutes after you close the presentation
  • A maximum of 30 users can follow your presentation
  • Learn more about this feature in our knowledge base article

Do you really want to delete this prezi?

Neither you, nor the coeditors you shared it with will be able to recover it again.

DeleteCancel

Make your likes visible on Facebook?

Connect your Facebook account to Prezi and let your likes appear on your timeline.
You can change this under Settings & Account at any time.

No, thanks

Szelén speciáció fermentlevekben, élesztőben, és táplálékkie

No description
by

Peter Fotyek

on 2 November 2013

Comments (0)

Please log in to add your comment.

Report abuse

Transcript of Szelén speciáció fermentlevekben, élesztőben, és táplálékkie

Szelén speciáció fermentlevekben, élesztőben, és táplálékkiegészítőkben
Nyomelemek
A különböző nyomelemeknek igen nagy szerepe van az életfolyamatokban, és jelentős mértékben befolyásolják az anyagok tulajdonságait, még ha a nevükből eredően nagyon kis mennyiségben vannak is jelen.
Célkitűzések
Manapság a szelénhiány okozta betegségek vizsgálatával, ezzel együtt a hiány csökkentésével, a szelénpótlás lehetőségeivel kapcsolatos kutatások kerültek előtérbe.
A tervezési feladat során én is ezzel foglalkozom.
Ezen belül is azzal, hogy a fermentációs eljárásokban milyen mennyiségben van jelen a szelén a kifejezetten erre a célra szánt termékekben, illetve ezt hogyan lehet analitikailag ellenőrizni.
Célok
A fermentációs eljárások közül az élesztő-fermentációt választottam ki, mivel az élesztőbe már igen régóta adagolnak szelént a szelényhiány pótolására.
Ehhez a körhöz tartozik a különböző táplálékkiegészítők előállítása is, mivel egyre több jelenik meg ezekből a piacon. Ezek kifejezetten a szelénhiány pótlását célzottak elvégezni.
Viszont kiemelkedően fontos, hogy megfelelően legyenek gyártva és ellenőrizve, mivel a szelén egyike azoknak a nyomelemeknek, amelyek nagyon szűk toleranciatartománnyal jellemezhetők, vagyis a szervezet optimális működéséhez szükséges és a toxikus mennyiség igen közel van egymáshoz.
Legfontosabb nyomelemek:
- cink,
- jód,
- kobalt,
- mangán,
- molibdén,
- réz,
- szelén,
- szilícium,
- vas.
A szelén az egyik legnagyobb mértékben tanulmányozott nyomelem, mivel közvetlen vagy közvetett módon mutattak már ki kapcsolatot a szelénhiánnyal. Például:
- felnőttkori cukorbetegség
- szürkehályog
- cisztás fibrózis
- agyérkatasztrófa
- vastagbél-fekélyesedés
- különféle ráktípusok (prosztatarák, vastagbél- és végbélrák, tüdőrák, stb.)
- szív- és érrendszeri betegségek
- lehetséges a kapcsolat a Down-szindrómával, Alzheimer-kórral, vagy az AIDS-el.
Speciációs analitika
Az elemek kémiai formája határozza meg a vegyület tulajdonságait, amit analitikai módszerekkel vizsgálhatunk. Az analitikai kémia kémiai módosulatok meghatározásával foglalkozó ágat módosulat analitikának nevezzük.
Az elemek
mobilitását
,
bioelérhetőségét
,
visszatartását
és
elraktározódását
élő szervezetekben, élelmiszerekben és a környezetben az határozza meg, hogy milyen
kémiai formában
kerül az elem az adott rendszerbe, milyen átalakulásokon megy keresztül – pl. metabolikus folyamatokban –, milyen végső formát vesz fel és mely formában fejti ki hatását.
A speciáció tehát az összkoncentráció meghatározása mellett az
elemek különböző formákban való eloszlását
definiálja és nyújt információt a vizsgált minta esetleges toxicitásáról, egészségre ártalmatlan voltáról vagy esszencialitásáról.
Speciációs analitika tervezett lépései:
Szelén kémiai sajátságai
Rendszáma 34, relatív atomtömege 78,96. Hat stabilis izotópja ismert, a leggyakoribb
80Se
-izotóp (relatív gyakorisága: 49,96%). Ezt követi a
78Se
(relatív gyakoriság: 23,61%), majd sorban;
76 Se
,
82 Se
és
77 Se
amely izotópok természetes előfordulása sokkal kisebb (rendre: 9,12; 8,84 és 7,5% rel. gyakoriság).
Többféle oxidációs számmal fordul elő, melyek: -II, 0, +IV és +VI, de vegyületei a +IV-es oxidációs állapotban a legstabilabbak.
A szelén megtalálható a talajban, a vizekben és a levegőben is, talajban: 0,1-0,3 µg/g, a levegőben 0,1-10 ng/m3, a felszíni vizekben pedig 0,06-400 µg/ l mennyiségben mutatták ki. Oldódásának mértékét a vizes közeg pH-ja nagyban befolyásolja. A szelénterhelés forrásai között említhetők: a vulkáni tevékenység, valamint az ipar, a közlekedés, a tüzelés és a mezőgazdaság.
Környezetben előforduló fő szelénvegyületek
A szelén szerves kötésben lévő formái, amelyekben a szelén szelenitként van jelen. Ezek leginkább szeleno-aminosavak, vagy azok származékai, amelyek tulajdonképpen olyan aminosavak, amelyekben a kén helyett szelén szerepel.
A szelén legfontosabb szerves formáinak tekintik a növényi eredető szelenometionint (SeMet), illetve az állati fehérjékből származó szelenociszteint (SeCys). Sem az állatok, sem pedig az emberek nem képesek szervetlen szelénforrásból metionint és ebből adódóan SeMet-t előállítani, így ezt a szeleno-aminosavat növényi vagy mikrobiális forrásból szükséges pótolnunk.
Biológiai mintákban: Szelenocisztin (SeC), Szelenocisztein (SeCys), Szelenometionin (SeMet), Szelenoetionin (SeE), Szelenourea (SeU).
Tervezés
Az analitikai mérések részletes és körültekintő tervezést igényelnek. A mérés céljának meghatározásakor figyelembe kell venni, hogy eredményeinknek mire és hogyan kell választ adniuk.
Az eredményt számszerűsítve, egy megbízhatósági tartománnyal együtt kell szolgáltatni. Ez után az igények, a mérendő minta és a felhasználható műszerpark ismeretében mérlegelni kell a rendelkezésre álló infrastruktúra által nyújtott lehetőségeket. Gyakorlatilag ez a lényege ezen kísérletttervezésnek.
Fermentáció
Az élesztőfermentáció célja a megfelelő mennyiségű és minőségű élesztő biomassza előállítása. Az élesztőgyártás alapelve az, hogy megfelelő szénhidrátdús keverékben (keményítő burgonya, gabona, kukorica, rozs, v. pedig cukorrépa, cukorgyári hulladékok, melasz keverékében) elszaporítják az élesztősejteket.
Az első esetben a keményítőt előzetesen (az árpamalátában levő diasztáz nevű enzim segélyével) elcukrosítják és tejsavas közegben dolgozzák fel, hogy a gabonafélék fehérjéit megfelelően aktiválhassák.
A cukorgyártási nyersanyagok felhasználásán alapuló gyártási módnál pedig az élesztők szaporodásának biztosítására nitrogéntartalmú és foszfor-segédanyagokat is kell még ammóniasók és szuperfoszfát alakjában alkalmazni.
Élesztő
A Saccharomyces cerevisiae (sütőélesztő) 3000 µg/g szelént tud asszimilálni. A fő cél a szeleno-methionin (SeMet), ami beépül az élesztő fehérjébe, vagy makromolekulákkal kapcsolódik, különösen sejtfal-elemekkel. a SeMet bioszintetikusan L-izomer formában jelenik meg az élesztőben.
A szeléntartalmú élesztőből és ételből származó proteinekből a SeMet be tud épülni a methionin helyére olyan fehérjékbe, mint az albumin vagy a hemoglobin. Alternatívaként transz-szelenálható szeleno cyszteinné (SeCys), ami konvertálható hidrogén-szeleniddé (H2Se) β-liázzal. A H2Se átalakítható szelenofoszfáttá (HSePO32-) szelenofoszfát szintetázzal.
Élesztő biomassza előállítás lépései:
Se
2,8,18,6
- Tervezés
- Mintavétel, minta tartósítása- és tárolása
- Részmintavétel
- Mintaelőkészítés
Extrakció és roncsolás
Az extrakciós hatásfok meghatározása
A szekvenciális extrakció
- Származékképzés
- Elválasztás
- Elválasztás utáni derivatizálás
- Eredmények kiértékelése
- A speciációs analitika minőségbiztosítása
- Detektálás
- Kalibráció
Mintavétel, a minta tartósítása és tárolása
A speciációs minták tartósítása a specieszek eredeti állapotban való megőrzése és különböző tulajdonságai miatt meglehetősen bonyolult.
A több oxidációs állapotban előforduló elemek egymásba alakulhatnak, a szerves vegyületek degradálódhatnak. Ez a szelénnél különösen veszélyes lehet, ezért igen fontos a megfelelő felkészülés. A legjobb, ha a mintavétel után a minták azonnali elemzése, de jelentős, hogy mennyi ideig tartható el a minta úgy, hogy a módosulatok eredeti állapotukban maradjanak.
Tervezés
Az analízis folyamatában a mintavétel a legelső lépés , melynél a legtöbb hibát lehet elkövetni, ezért talán a mintavételt kell a lekörültekintőbben megtervezni.
A tapasztalat azt mutatja, hogy a mintavétel mindenkor egy jelentős hibaforrás:

a mintarészletnek reprezentatívnak kell lenni, különben az eredmény nem vonatkoztatható az egész anyagra

az eredmény függhet (általában függ is) a választott analitikai módszertől, de mindig függ a mintavétel módjától

a technológiás és a tudományos fejlődésnek köszönhetően az analitikai módszerek egyre kisebb mintarészletet igényelnek, így a nem megfelelő mintavélnek egyre nagyobb a jelentősége

ha nincs egyéb előírás, a mérésket végző analitikus tapasztalatára kell hagyatkozni és a korábbi tapasztalatokon alapuló hasonló alkalmazásokat követni

ha a minta állapotának megítélésénél kétség merül fel, a mintát heterogénnek kell tekinteni

a méréseket kizárólag a feladatra képzett, tapasztalattal rendelkező személy végezheti.
Mintavétel, a minta tartósítása és tárolása
A speciációs mintavételnél elengedhetelen szempont a mérendő elemek kémiai formáinak eredeti állapotban való megőrzése!
Lehetséges, hogy már az eredeti közegből való kiemeléssel megváltoztatjuk az eredeti egyensúlyi viszonyokat, melyek következtében a módosulatok szerkezete megváltozhat. Például az elemek fehérjékhez, huminsavakhoz és üledékminták részecskéihez nem kovalensen kapcsolódó kémiai formáinak egyensúlya könnyen felborul akár kisebb pH, redoxipotenciál vagy az oldott oxigén koncentrációjának megváltozására.
Részmintavétel
A vizsgálati mintarészlet a mintából kiválasztás vagy osztás útján nyert mintatarészlet; a minta egy részleteként választott egység, egy többlépcsős mintavétel utolsó egysége, melyet elemzés céljára választanak ki.
A speciációs analitikai mérések kimutatási határa ma már lehetővé teszi a kis mintamennyiség alkalmazását. Ez egyszerre előnyös és hátrányos. A kisebb mintamennyiségnek kisebb a vegyszer-, így költségigénye. Viszont minél kisebb a minta mennyisége, annál nagyobb az esélye annak, hogy a minta szennyezése torzítja a teljes mintáról adott képet
Extrakció és roncsolás
A mérendő módosulatokat a lehető legnagyobb százalékban kell szerkezetváltozás nélkül elválasztani a zavaró hatásokat okozó mátrixtól. Ekkor kompromisszumokat kell alkalmazni, így romlik a hatásfok.
Az extrahálószer kiválasztása során az oldószer két feladatot lát el: a kötések felbontásával vagy az aktív helyekről való elválasztással felszabadítja a mérendő alkotót a mátrixból; és megakadályozza, hogy a mérendő és a mátrix újból kölcsönhatásba lépjen, readszorbeálódjon vagy esetleg irreverzibilisen komplexet képezzen.
Származékképzés
A derivatizálás elsősorban a mintamátrixtól való elválasztást biztosítja, amellyel nem csak a detektálást zavaró mátrixhatásokat küszöböljük ki, de a komponens mintabeviteli hatásfokát is növeljük. A legelterjedtebb derivatizálási módszerek:
• hidridfejlesztés,
• alkilálás Grignard reagenssel,
• alkilálás tetraalkil-borátokkal

Elválasztás
A speciációs analitikában erre a célra leginkább három technikát alkalmaznak: - gázkromatográfiát (GC)
- folyadékkromatográfiát (LC)
- kapilláris elektroforézist (CE).
Elválasztás utáni derivatizálás
Az elválasztás utáni derivatizáció megfelelő fizikai, kémiai kondíciókat – pH, hőmérséklet, energiaközlés stb. - itt is biztosítani kell. Mivel mindezt zárt rendszerben kell megoldani úgy, hogy a már véghezvitt elválasztás ne változzon.
A szeleno-aminosavak – szeleno-metionin (SeMet), szeleno-cisztin (SeCys), szeleno-etionin (SeEt) – és Se(IV) és a Se(VI) ionos formák a hosszú apoláris lánccal rendelkező kvaterner ammónium só - pl.: didodecil-dimetil-ammónium bromid (DDAB) – alkalmazásával, ionpárképző kromatográfiával elválaszthatók, és az igen érzékeny AFS detektorral meghatározhatók.
Detektálás
Speciációs kapcsolt rendszereknél nem ismert retenciós idővel megjelenő csúcsoknál meg kell bizonyosodni, hogy a mért jelet a mérendő adja és nem az interferenciák.
Napjainkban a speciációs analitikában a leginkább alkalmazott és legérzékenyebb, a szimultán multielemes elem (tömeg) specifikus detektor. Jelentős számban az
ICP-kvadrupol-MS
-t alkalmazzák, de egyre több a gyakorlati alkalmazása a repülési idő
ICP-TOF (time-of-flight)-MS
-nek, az új generációs nagy felbontású
ICP-HR(high resolution)-MS
-nek, az
ICP-SF(sector-field)-MS
-nek, a tranziens jelek izotóparányainak szimultán mérésére alkalmas
ICP-MC(multicollector)-MS
, a spektrális interferenciák csökkentésére kifejlesztett dinamikus reakció cellát alkalmazó
ICP-DRC(dynamic reaction cell)-MS
-nek és az ütközési cellát alkalmazó
ICP- collision cell-MS
-nek.
Kalibráció
A speciációs analitikai koncentrációk mennyiségi meghatározása és a mennyiségi meghatározás legmegfelelőbb módjának kiválasztása a mai napig a terület fontos kérdése.
A két legelterjedtebb megoldás a ’hagyományos’ kalibráció és az ún. belső kalibráció - a standard addíció .
Eredmények kiértékelése
A leglényegesebb szempont az, hogy az értéket felreérthetetlen módon adjuk meg.
A kinyerési hatásfok megadásának módja is igen fontos a különböző korekciók miatt.
A speciációs módszerek bonyolultsága miatt, mely többnyire a mintaelőkészítések összetettségéből ered, lényegesen több a kiértékelési hibák elkövetésének esélye.
Az eredmények kiértékelését az egyetemen megismert Statistica szoftverrel tervezem végezni.

Minőségbiztosítás
Ha létezik a feladatnak megfelelő szabvány ill. módszer az alkotó meghatározására, akkor azt kell használni!
Ha nincs előírás, akkor módszert kell fejleszteni. Az analitikai mérésnek megbízhatónak kell lennie.
Követelmények:

Az analitikai méréseknek meg kell felelnie az felhasználó előzetes követelményeinek, céljainak.

A mérések során olyan módszereket és műszert kell használni, amelyekről előzetesen meggyőződtünk, hogy a célnak megfelelnek.

Az analitikusnak megfelelő képesítéssel és tudással kell rendelkeznie a feladat elvégzéséhez.

A laboratórium tevékenységét időközönként független szervezetnek kell megvizsgálnia (akkreditálás).

Az egyik laboratóriumban végzett mérés eredményének összevethetőnek kell lennie a másikban végzett elemzési eredményekkel.

Az analízist végző szervezeteknek jól definiált minőségbiztosítási és minőségellenőrzési eljárásokkal kell rendelkezni.

Vizsgálandó minták
A mérések során különböző típusú minták vizsgálatát tervzem:
- Szelénmentes élesztő (ez elsősorban a minta hitelessége miatt szükséges kontrollnak)
- Szeléntartalmú élesztőminta 1. típus (fermentlében)
- Szeléntartalmú élesztőminta 2. típus
- Szeléntartalmú táplálékkiegészítő 1. típus
- Szeléntartalmú táplálékkiegészítő 2. típus
- Nyers táplálékkiegészítő szelén adagolás előtt
- Brazil dió (egy igen magas szeléntartalmú
természetes anyag)
A HPLC-(fűtés -UV)-HG-AFS rendszer működése
A 20-200 µL térfogatú minta a mintabejuttató egység segítségével az eluensáramba jut és a megfelelő eluens és kromatográfiás program alkalmazásával a vizsgált módosulatok elválnak az állófázison.
Az oszlop után perisztaltikus pumpa segítségével nyomásálló PEEK reakciókamrában az eluensáramba kerül a savoldat és direkt hidridfejlesztést alkalmazásakor a borohidrid oldatottal együtt. Ha a rendszerben oszlop utáni redukciót alkalmazunk, akkor a savoldat helyett sav-KBr keveréket használunk. Az eluens-sav-KBr keverék a 200 °C-ra állított elektromos fűtőegységbe, majd onnan a UV roncsolóba jut, ahol előzőleg összesen 12 méter 0.8 mm id hőálló tefloncsővet helyeztek el.
Innen egy jéghűtőn keresztül visszavezetjük az áramot a PEEK reakciókamrába és hozzávezetjük a borohidrid oldatot.
Az oldat a folyadék-gáz szeparátorba jut, majd innen argonáram szállítja a Perma Pure folyadékmentesítőn keresztül a száraz gázt a detektor lángjába.

HATÓ
KROMATO-GRAMOK
VÁR-
Eredmények értékelése
Az eredmények statisztikai kiértékelését minden esetben STATISTICA software-rel végzem az előzőekben leírt értékelési elvek, módszerek alapján.
KÖSZÖNÖM A FIGYELMET!
Készítette:
Fótyék Péter
Biomérnök Bsc
Témavezető:
Dr. Fodor Péter
Full transcript