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Extracción y purificación de enzimas

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on 4 November 2017

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Extracción y purificación de enzimas
El método de purificación debe diseñarse desde un principio teniendo en cuenta la cantidad de proteína que se requiere.

Hay etapas de purificación que se pueden aumentar de escala fácilmente y otras en que no es posible hacerlo.

El grado de pureza necesario dependerá del uso que se va a dar a la proteína.








Si el interés está en la proteína y no importa el organismo de origen, conviene buscar una fuente fácil de obtener, barata, que contenga esa proteína en abundancia.
Dependiendo de la finalidad, la proteína debe ser obtenida en estado nativo o puede estar desnaturalizada.
Se debe seleccionar un método de determinación específico de la proteína en cuestión:
La actividad específica (AE) es igual a la relación entre la cantidad de proteína que se purifica sobre la cantidad de proteína total.
Métodos adecuados para juzgar la pureza de la proteína obtenida.
SDS-PAGE, monodimensional o bidimensional.
ultracentrifugación analítica.
ESQUEMA GENERAL DE UN METODO DE PURIFICACIÓN

1) Separación de las células.
2) Si la proteína es intracelular, ruptura celular y separación de restos.
3) Concentración.
4) Aislamiento primario.
5) Purificación de
alta resolución.
6) “Pulido” del
producto final.








Problemas a ser resueltos para diseñar el proceso:

1) Elegir etapas basadas en diferentes principios fisicoquímicos.
2) Elegir entre operaciones alternativas, en base a la escala final buscada.
3) Diseñar una secuencia de etapas óptima, con el menor número de etapas
posible, lo que aumentará el rendimiento final.
4) Minimizar la desnaturalización y efectos de superficie; evitar agregación: minimizar la degradación; cuidar la limpieza y desinfección del equipo usado.
Extracelular
Intracelular
MÉTODOS PARA LA RUPTURA DEL MATERIAL
Las células o tejidos deben romperse para extraer la proteína de interés, pero esta ruptura debe ser sólo la necesaria, no excesiva, para evitar la extracción inútil de proteínas contaminantes.
Fáciles de romper, pues carecen de pared.
Fáciles de romper, pese a tener pared celular, su gran tamaño las hace vulnerables a la ruptura mecánica.
El peptidoglicano en la pared, las hace mucho mas sensibles a métodos suaves, como la digestión con lisozima.
Más resitentes carecia de peptidoglicano en pared celular.
Son los más resistentes a la ruptura. Tienen paredes celulares que contienen hasta 80 - 90 % de polisacárido (quitina y glicanos en hongos, manano y glucano en levaduras), además de lípidos y proteínas.
ALGUNOS MÉTODOS DE RUPTURA DE CELULAS
1) Mortereado con arena, alúmina, vidrio,
carburo de silicio.



2) Molinos de ruptura, por agitación con abrasivos.




3) Uso de licuadoras u otros dispositivos con cuchillas.



4) Sonicación.



5) Congelación y descongelación.



6) Extrusión de líquido o sólido (material congelado)


7) Descompresión explosiva.





8) Enzimas líticas, seguido por
shock osmótico





9) Detergentes (Triton, digitonina)
o solventes (tolueno).



10) Aislamiento previo del organelo en que se encuentra la proteína.
Remoción de agua y moléculas pequeñas por:

1) Agregado de un polímero seco con poros
muy pequeños como para que la proteína
penetre (Sephadex G-25).




2) Remoción a través de una membrana semipermeable
Ultrafiltración
Celdas filtrantes




3) Remoción de agua en vacío
Liofilización


4) Cambios de buffer
Diálisis
Filtración por gel
Diafiltración.
MÉTODOS DE SEPARACIÓN
PURIFICACIÓN Y CONCENTRACIÓN POR PRECIPITACIÓN
1) Precipitación por aumento de la fuerza iónica (salting-out)

2) Precipitación por disminución de la fuerza iónica (salting-in)

3) Precipitación por alteración del pH (mínima solubilidad en pI)

4) Precipitación por solventes orgánicos (etanol, acetona), que
disminuyen la constante dieléctrica de la solución y con ello su poder de solvatación.

5) Desnaturalización de impurezas por altas temperaturas, extremos de pH, solventes orgánicos.
PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS
Fraccionamiento cromatográfico
Filtración en gel
Intercambio iónico
Afinidad
Cromatoenfoque
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