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Improved drought and salt tolerance of Arabidopsis thaliana

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by

Lucía Campos

on 26 November 2013

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Transcript of Improved drought and salt tolerance of Arabidopsis thaliana

Improved drought and salt tolerance of
Arabidopsis thaliana
by transgenic expression of a novel DREB gene from
Leymus chinesis

DREB
Materiales y Métodos
Homólogos encontrados
Arroz
Algodón
Soja
Diferentes proteínas DREB pueden desempeñar diferentes funciones en las plantas y pueden estar involucradas en muchas vías durante el curso de una respuesta a estrés abiótico
Leymus chinesis
Estudiar la respuesta al estrés abiótico
Se aisló el gen de LcDREB3a de
L.chinesis
y se investigó los patrones de expresión y sus funciones en
Arabidopsis thaliana.
Porqué y qué es LcDREB3a
Es un gen que codifica para un factor de transcripción de la resistencia a la sequía, y a su vez tiene la posibilidad de activar genes reporteros y de unirse a una región conservada de DRE
Materiales y tratamiento de las plantas
Se plantaron semillas de L.chinesis en suelo por 8 semanas
Plantulas para estrés por frío en cámara a 4ºC
Para estrés por sal 400mM NaCl
ABA 100 microM
Sequía PEG6000 20%
Extracción ARN y clonado del largo total de ADNc
Tejido completo de las plántulas fue congelado en nitrógeno líquido hasta su uso.
Se extrajo el ARN por medio de un kit y se determinó por Nano Drop 2000
Se removió el ADN con un kit.
RACE cDNA
Se realiza con el fin de obtener la secuencia completa de un ARN , por medio de ADNc.
1- Utiliza al ARNm como molde desde uno de los extremos. Primers (GSP)
2- Se utiliza el ADNc anterior como molde y por medio de primers se obtiene le largo completo del ADNc.

Todos los productos de PCR se ron en el vector
pMD18-T
y se secunció.

Se realizó una RT-PCR utilizando como contro la actina (expresión constitutiva)
Real-time PCR
Expresión transiente y localización subcelular
El gen de interés se combino en el N terminal con
GFP
.
Se insertó en un nuevo vector (pCombia 1302) y se introdujo por biolística dentro de células de tejido de cebolla.
Se observó por confocal.
Ensayo de actividad transcripcional y unión específica a DRE
Región codificante de LcDREB3a vector pBridge conteniendo un dominio de unión a GAL4
Se introdujo en levadura AH109 con genes reporteros
Diferentes construcciones de vectores como controles
Se realizó
colony-lift filter B-galactosidase assay
Transformación de Arabidopsis
ADNc del gen de interés fue ligado a un vector bajo el control del promotor CaMV 36S.
Control negativo vector vacio
Se transformo
A.thaliana
con
Agrobacterium tumefaciens EHA105
Se confirmo por PCR
Análisis de estrés abiótico en
Arabidopsis
NaCl _________________Sal
-6ºC _________________Frío
125mM mannitol_____Sequía

Test de germinación
NaCl
Resultados
cADN y análisis filogenético de
LcDREB3a
1543 pb
marco de lectura de 369 aa
masa molecular proteína putativa 40kDa
dominio conservado de unión al ADN
Secuencia de localización nuclear
RKKRPRR
Expresión de LcDREB3a
Localización de la proteína en cebolla
Actividad transcripcional de la proteína LcDREB3a
Tolerancia al frío, sequía y frío de
Arabidopsis
transgénica
Discusión
Se aisló LcDREB3a de un cultivo resistente a las altas concentraciones de sal y a la sequia.

Homología:
62-89,6% familia Poaceae
23.3-35,5% plantas dicotiledóneas
Respuesta al estrés de L.chinesis
LcDREB se encuentra regulado positivamente en respuesta a la baja temperatura, ABA, sal o al tratamiento osmótico
Análisis de la estructura
Reveló un péptido señal, indicando el potencial de localización nuclear.
Análisis híbrido de levadura
Habilidad de activación basado en la unión especifica del mismo a DRE/CRT y promover la expresión de genes reporteros
Mientras que en Arabidopsis
Comportamiento puede deberse al tipo de DREB.
DREB1 - frío
DREB2 - sequía y alta [sal]
Otro tipo de estrés
Heridas, ejemplo la poda.
Inducen expresión LcDREB1a
L.chinesis diferente A.thaliana
Si bien son diferentes , la expresión transgénica del gen no colapsa los sistemas de la planta.
Respuesta al estrés de A.thaliana
Sequía
debajo de 125mM manitol crecimiento más rápido
NaCl evaluado en germinación
Germinación en un 80%
Frío
No se observo respuesta

Concentraciones mayores de sal y manitol esta seguramente regulado por otro genes
AtRD29A


AtSAMDC
Se detectó un gen de respuesta .
PCR en tiempo real .
La expresión transgénica de LcDREB3a lleva al aumento de la expresión de AtSAMDC.
SAMDC enzima involucrada en la biosíntesis de la spremine y spermidinem
Conclusión
Se logró
aislar el gen LcDREB3a.
Se logró transformas a Arabidopsis thaliana con el gen.
Mejor respuesta frente
a la seguía
las altas concentraciones de sal
No se observó respuesta frente al frío.
Este estudio permite conocer mejor como actúan en particular el gen LcDREB fente al estrés, y puede ser utilizado para poder generar cultivos resistentes al estrés.
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