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Protocolo de aislamiento de cepas de Aspergillus niger a par

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Giovanna Rodas

on 29 May 2015

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Transcript of Protocolo de aislamiento de cepas de Aspergillus niger a par

El cultivo de microhongos filamentosos se lleva a cabo principalmente en medio líquido, conteniendo éste todos los nutrientes necesarios que aseguren su crecimiento.
METODOLOGÍA
Agar de Dextrosa y Papa (PDA)
Las colonias fúngicas formadoras producen zonas amarillas (0.5 – 1.5cm) debido a la formación de ácido.

INTRODUCCIÓN
Aislamiento

Aristegui, B. 2002. El reino de los hongos. Rev Iberoam Micol, 1-3.
Cochrane, J. D. 1963. Equatorial undercurrent and related currents off Brazil in March and April 1963. Science, 142(3593), 669-671.

Garcia R. ,Trejo D., Ferrera C., Varela L., Lara L., & Alarco. A. 2011. Efectividad de siete consorcios nativos de hongos micorrízicos arbusculares en plantas de café en condiciones de invernadero y campo. Revista chilena de historia natural, 84(1), 23-31.

Guzmán, G. 1977. Identificación de los hongos. Comestibles, venenosos, alucinan.

Kavanagh, K. 2005. Fungi: Biology and Applications. Wiley-Blackwell. 280 pp.

Mangiaterra M, Esquivel P Giusiano G, Sosa MA. 2003. Microhongos anemófilos ambientales en dos ciudades del nordeste argentino. Bol Micol;18:21–8.

Smith G. Introducción a la Micología Industrial. Ed. Acribia, Zaragoza. España.1963

Torrenegra R. Samira R. 2005. Evaluación de los ácidos grasos en especies de Aspergillus sp como criterio taxonómico. Pontificia Universidad Javeriana.

RESULTADOS
OBJETIVO
Protocolo de aislamiento de cepas de
Aspergillus niger
a partir de un fruto cítrico y su identificación

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE NUEVO LEÓN
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS


MICROBIOLOGÍA

PIA III
Protocolo de aislamiento de cepas de
Aspergillus niger
a partir de un fruto cítrico y su identificación

Dra. Sandra Castillo Hernández

Grupo 121

Integrantes del Equipo:
Lynnette García Flores
Giovanna Pamela Rodas Cano
Itzel Montserrat Proa Guerrero
Luis Daniel Maldonado Hernández
Daniel Alejandro Hernández Rodríguez



San Nicolás de los Garza, Nuevo León a 28 de Mayo de 2015.

Identificación de
Aspergillus niger
Factores
Existencia de oxigeno requerido, grado de humedad apropiadas, valores de pH adecuados.
El género Aspergillus comprende alrededor de 180 especies, son hongos filamentosos, hialinos y ubicuos.
Se reproducen asexualmente por conidios que se originan de grupos de fiálides localizadas en un ensanchamiento terminal del conidióforo.
Las colonias fúngicas formadoras producen zonas amarillas (0.5 – 1.5cm) debido a la formación de ácido. Para el asilamiento de Aspergillus se utiliza un medio de cultivo que se prepara a partir de infusión de patata y dextrosa donde crece rápidamente. El micelio es de color amarillo brillante y produce cabezas de conidios de color café oscuro. Las cabezas de los conidios tienen forma de globos.
Figura 1. Morfología microscópica de
Aspergillus
Para cultivo de hongos y levaduras en productos lácteos, bebidas embotelladas y alimentos. La infusión de papa como fuente de almidones y la dextrosa son la base para el crecimiento de hongos y levaduras.
Disolver 1.9 g de PDA en 50 mL de agua destilada. Reposar 10 a 15 minutos. Calentar agitando frecuentemente hasta el punto de ebullición durante 1 minuto para disolverlo por completo. Ajustar el pH a 5.6 con solución de HCL 0.1N o de NAOH 0.1N, según sea el caso. Repartir en 10 tubos, colocando 5mL de medio en cada tubo. Esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 minutos. Sacar de la autoclave y colocarlos en posición inclinada para generar una amplia superficie cuando el agar se solidifique. Si se acidifica el medio, no sobrecalentar y fundir solo una vez, para evitar la hidrólisis del agar.
PREPARACIÓN
1.- Tomar con un asa al hongo que está visible en la superficie de un limón (puede ser cualquier cítrico) picado y colocado en la oscuridad por una semana.
Aspergillus niger
forma esporas de color oscuro.

2.- Sembrar colocando el hongo en el centro de una caja Petri que contenga medio sólido de Agar de Dextrosa y Papa (PDA).

3.- Incubar las cajas de petri inoculadas a 30ºC durante un periodo de 4 a 6 días, para permitir el crecimiento del hongo.

4.- Las colonias jóvenes de
Aspergillus niger
son transferidas con un asa a tubos con agar papa dextrosa PDA inclinado.

5.- Incubar los tubos con agar inclinado inoculados a 30ºC por un periodo de 4 a 6 días para lograr una esporulación abundante. Los conidios de Aspergillus niger son de color oscuro.

6.- Conservar los tubos esporulados a 4ºC, como cultivos de trabajo.

LITERATURA CITADA
Debido a las características que presentan los organismos del género Aspergillus, se llegó a la conclusión de que efectivamente se aisló con éxito una cepa del antes mencionado género; al comparar fotografías (en objetivo de 100X) del hongo Aspergillus flavipes (Figura 3) con los resultados obtenidos, se pudo observar un gran parecido en la estructura del hongo que fue aislado, por esto, es posible suponer que este es el organismo que se encuentra aislado en un cultivo puro (Figura 5).
Antes de lograr un cultivo puro del hongo, se obtuvieron 3 placas contaminadas del inoculo del hongo posible Aspergillus, y una caja con el cultivo puro de este hongo (Figura 4). El objetivo de este proyecto no se cumplió, ya que la especie que originalmente se buscaba es Aspergillus niger, pero a causa de diversos factores, no fue capaz de ser aislado.
Figura 4. 4a. Parte frontal del cultivo con aspecto polvoriento, colonia de 8 cm a los 8 días, color amarillento en el centro, en las zonas más desarrolladas. 4b. Reverso del cultivo con aspecto cremoso, color amarillento en la parte central de la colonia, era observable un crecimiento regular.
Figura 5. Aspergillus flavipes. 5a. Cultivo puro de 8 días de Aspergillus flavipes en placa con PDA (colonia de 8 cm). 5b, c. Estructura microscópica de Aspergillus flavipes (40X).
CONCLUSIÓN
No se logró obtener el organismo deseado (
Aspergillus niger
), en cambio se obtuvo
Aspergillus flavipes
, esto pudo ser debido a que la forma de colectar cualquier tipo de hongo es muy aleatoria, en este caso utilizamos un limón como fuente de recolección para dicho organismo y según la fuente consultada, esto también puede atraer a las centenas de especies de hongos que existen alrededor o en nuestro medio ambiente, haciendo aún más difícil la colecta del organismo en específico.
La especie perteneciente igualmente al género Aspergillus, se logró aislar y cultivar exitosamente. Posteriormente fue identificada en el microscopio usando una tinción simple con azul de lactofenol. Con este método se detectó perfectamente el tipo de hifas y conidios que forman la estructura de este hongo. Finalmente puede concluirse que la forma de recolecta de algún hongo microscópico especifico debe ser estudiada a fondo y si puede ser posible utilizar diferentes fuentes o formas de capturar el organismo deseado, como por ejemplo usando más vegetales o receptores donde el organismo sea capaz de alojarse.
La temperatura influye en el crecimiento, la germinación de esporas, reproducción y, en general, todas las actividades del organismo (Alexopoulos et al; 1996). La mayoría de los hongos crecen a un rango de temperatura entre 25 a 30°C (Kavanagh, 2005). Dado que la incubadora está más ajustada a las condiciones óptimas a las que crecen las bacterias que hongos, se cree que este factor pudo repercutir en el resultado. Finalmente días próximos a la entrega del cultivo puro se optó por dejar el cultivo a temperatura ambiente para permitir su crecimiento.
Discusión

El pH es también un factor fundamental para el desarrollo de los hongos, a un pH alto se ve afectada la solubilidad de los metales y a pH bajo se afectan los sistemas enzimáticos, el ingreso de vitaminas esenciales y ácidos orgánicos y la toma de minerales (Cochrane, 1963). El pH óptimo para hongos se encuentra entre 4 y 6 (Kavanagh, 2005). No se realizaron pruebas especiales para definir el pH al que se encontraba el cultivo, este podría ser otro aspecto que afectó el resultado. La inestabilidad de las cepas y el constante movimiento, tanto como el hecho de no contar con temperaturas adecuadas e incluso el pH, dio lugar a que la identificación fuera un poco más complicada, ya que algunos géneros y especies son más sensibles a variaciones por factores medioambientales; característica que coinciden con lo expuesto por Smith en 1963.
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