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Fundamento y utilidad de técnicas empleadas para el diagnóstico en la Inmunología

Seminario # 2 Inmunología
by

Lizeth Sellers

on 18 February 2013

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Transcript of Fundamento y utilidad de técnicas empleadas para el diagnóstico en la Inmunología

Seminario # 2 Fundamento y utilidad de técnicas empleadas para el diagnóstico en Inmunología -Miriam Delgado -Arturo Duarte -Fernando García
-Saeed Díaz -Karen Espinosa -Mayela Gzz
-Said Díaz -Karla García -Gaby Gzz
-Melissa Guajardo ELISA FUNDAMENTO Electroforesis de proteínas del suero FUNDAMENTO UTILIDAD PROCEDIMIENTO UTILIDAD PROCEDIMIENTO Western Blot Qué es y para que es una prueba de Western Blot? PROCEDIMIENTO Qué es ELISA? *Acrónimo en inglés para enzimoinmuno análisis de adsorción y es un examen de laboratorio comúnmente usado para detectar anticuerpos en la sangre.

*Es una herramienta fundamental de la inmunología clínica y se utiliza como pantalla inicial para la detección del VIH. Basándose en la interacción anticuerpo-anticuerpo, este ensayo permite la fácil visualización de los resultados y se puede completar si la preocupación adicional de uso de materiales radioactivos. Una prueba de ELISA AUUUUUCH!! Riesgos *Las venas y arterias varían de un paciente a otro y de un lado del cuerpo a otro: por esta razón es más difícil obtener una muestra de sangre de algunas personas.



-Sangrado excesivo.
-Desmayo o sensación de mareo
-Hematoma
-Desmayo Riesgos leves: Para qué es ELISA? Se realiza en las enzimas y su nombre viene del término inglés "Enzyme-linked inmunosorbent essay" que quiere decir "ensayo inmunoenzimático ligadoa enzimas".
Se usa en muchos laboratorios para determinar si un anticuerpo particular está presente en la muestra de sangre de un paciente. Aunque el procedimiento es rutinario y sencillo involucra un gran número de variables.
-Selección de reactivo.
-Temperatura.
-Medición de volumen.
-Tiempo.
Si no se ajustan correctamente pueden afectar los pasos sucesivos y al resultado de la prueba. *ELISA fue la primera prueba de selección ampliamente usada para el VIH debido a su alta sensibilidad.
*Esta prueba se utiliza a menudo para ver si se ha estado expuesto a virus u otras sustancias que causan infección. *Lo que hace esta prueba es usar una enzima para mediar la formación de complejos antígeno-anticuerpo, logrando el reconocimiento del agente por una reacción coloreada.

*En efecto ELISA no solamente se utiliza para la detección de VIH. Además se utiliza para el diagnóstico inmunológico de muchas enfermedades de tipo infeccioso y autoinmunes.

*Detecta Helycobacter pylori, agentes infecciosos que producen la enfermedad de Lyme, enfermedades dermatológicas ampollosas, sífilis Electroforesis La electroforesis se basa en un principio básico y bastante simple: la migración de partículas en un campo eléctrico (un campo eléctrico es un campo de fuerza generado por dos cargas eléctricas). Entonces, cuando tu pones cualquier partícula en un campo eléctrico esta migrará hacia el polo positivo (ánodo) o negativo (cátodo) según sea su carga. En la electroforesis lo que se hace es disolver las partículas que se quieren separar y medir en un solvente y colocarlas en un campo eléctrico para que estás migren según su carga Pero aquí hay un problema ... Cómo se soluciona esto? Fácil, se utilizan geles, como el gel de poliacrilamida. Las ventajas de utilizar gel como solvente son que, debido a sus propiedades hará más compacto el soluto lo que anulará las fuerzas de fricción y de movimiento browniano, además gracias a su porosidad separará las partículas grandes de las pequeñas dificultando el paso de las grandes y facilitando el paso de las pequeñas, todo esto obviamente en función de su peso molecular. …las partículas tendrán cierta fricción con el solvente lo que hará que las partículas no migren de manera homogénea lo que con el tiempo ocasionará que el soluto forme un frente muy ancho haciendo imposible tener un criterio para distinguir una partícula de otra, además, por si eso fuera poco las partículas tendrán energía cinética propia lo que ocasionará que se muevan aleatoriamente (movimiento browniano) dificultando aún más su estudio. Normalmente la electroforesis se utiliza para separar proteínas y en base a los principios anteriormente descritos saber si los valores están elevados o disminuido La muestra preferida para el análisis de proteínas es el suero ya que los factores de coagulación presentes en el plasma no permiten distinguir las variaciones en los valores de las beta y gamma globulinas. Las proteínas presentes en el suero son 5: Albúmina, alfa-1 globulinas, alfa-2 globulinas, beta globulinas y gamma globulinas (IgG, IgA, IgM, IgE e IgD). En el siguiente cuadro se resume las gama de trastornos que pueden ser diagnosticados gracias a este estudio. Qué se necesita para hacer ELISA? * No es necesario ayunar pero si evitar muestras quilosas. Muestras altamente hemosiladas pueden causar coloración al suero. *Entígenos o anticuerpos industriales para atrapar lo que se busca de la muestra problema *Superficie cubierta industrialmente recubierta para pegar el antígeno anticuerpo buscando a la pared (inmunoabsorbente). *propiciar el ambiente adecuado para que ocurra la acción. * Medir coloración de la muestra. Procedimiento: Presentación de tejido: *Se pueden tomar muestras de tejido completo o de un cultivo celular. las muestras de virus o ambiental puede ser la fuente de proteína y por lo tanto el Western Blot no se limita a los estudios celulares solamente.

Surtido de detergentes, sales y tampones se pueden emplear para estimular la lisis de las células y para solubilizar proteínas.
más altos. La electroforesis en gel Las proteínas de la muestra se separan mediante electroforesis en gel . La separación de proteínas puede ser por punto isoeléctrico, peso molecular, carga eléctrica, o una combinación de estos factores. La naturaleza de la separación depende del tratamiento de la muestra y la naturaleza del gel. el tipo más común de electroforesis en gel emplea poliacrilamida geles y tampones cargados con dodecil sulfato sódico SDS). SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida SDS) mantiene polipéptidos en un estado desnaturalizado una vez que han sido tratados con agentes reductores fuertes para eliminar secundaria y la estructura terciaria (por ejemplo, enlaces disulfuro [SS] a los grupos sulfhidrilo [SH y SH]) y por lo tanto permite la separación de proteínas por su peso molecularcuanto menor sea la concentración de acrilamida mejor es la resolución de proteínas de peso molecular Transferencia El método principal para la transferencia de las proteínas se denomina electrotransferencia y utiliza una corriente eléctrica para tirar de las proteínas desde el gel a la membrana de nitrocelulosa o PVDF.

Con el fin de hacer que las proteínas accesibles para la detección de anticuerpos que se mueven desde el interior del gel a una membrana hecha de nitrocelulosa o difluoruro de polivinilideno (PVDF)

Un método más antiguo de transferencia implica la colocación de una membrana en la parte superior del gel, y una pila de papeles de filtro en la parte superior de eso. Bloqueo Puesto que la membrana ha sido escogido por su capacidad para unirse a proteínas y como los anticuerpos y la diana son proteínas, se deben tomar medidas para prevenir las interacciones entre la membrana y el anticuerpo utilizado para la detección de la proteína diana

El bloqueo de la unión no específica se logra mediante la colocación de la membrana en una solución diluida de proteína - típicamente 3-5% albúmina de suero bovino (BSA)

La proteína en la solución diluida se une a la membrana en todos los lugares en los que las proteínas objetivo no se han adherido

Así, cuando el anticuerpo se añade, no hay lugar en la membrana para que se adjunte otro que en los sitios de unión de la proteína diana específica. Detección Durante el proceso de detección de la membrana se "probaron" para la proteína de interés con un anticuerpo modificado que está ligado a una enzima reportero; cuando se expone a un sustrato apropiado esta enzima conduce una reacción colorimétrica y produce un color. Dos pasos
Los anticuerpos primarios se generan cuando un host especie o cultivo celular inmune se expone a la proteína de interés (o una parte del mismo). Normalmente, esto es parte de la respuesta inmune, mientras que aquí se cosechan y se utilizan como herramientas de detección sensibles y específicos que se unen a la proteína directamente.
Después del bloqueo, una solución diluida de anticuerpo primario (generalmente entre 0,5 y 5 microgramos / ml) se incubó con la membrana con agitación suave. T Anticuerpo primario Anticuerpo secundario Después de enjuagar la membrana para eliminar el anticuerpo no unido primario, la membrana se expone a otro anticuerpo,
Los anticuerpos son de origen animal, El anticuerpo secundario está generalmente ligado a biotina o a un reportero enzimatal comofosfatasa alcalinao peroxidasa de rábano picante. Esto significa que varios anticuerpos secundarios se unen a un anticuerpo primario y mejorar la señal.
Más comúnmente, una peroxidasa de rábano picante -ligado secundario se utiliza para escindir un agente quimioluminiscente, y el producto de reacción produce luminiscencia en proporción a la cantidad de proteína. Una lámina sensible de la película fotográfica se coloca contra la membrana, y la exposición a la luz de la reacción crea una imagen de los anticuerpos unidos a la mancha. Procedimiento: 1. Se lavan los vidrios y se secan con papel para finalmente limpiarlos con una gasa humedecida en etanol 70 %.
2. Montar el sistema segun las instrucciones de la cámara de electroforesis.
3.- Introducir el peine y marcar un cm por debajo del límite inferior de éste. 4 Preparar el gel separador en un tubo Falcon de 15 mL. 5. Mezclar bien y tranferir la mezcla hasta la marca realizada en el paso 3.
6. Añadir agua destilada para cubrir el gel y verificar que este se encuentre plano. Esperar a que polimerice..
7 Retirar el agua y remover restos con papel secante. 8. Preparar el gel concentrador 9. Vaciar y colocar el peine. Esperar a que polimerice.
10. Colocar el gel en la cámara de electroforesis y llenar con buffer de corrida los compartimientos..
11. Preparar las muestras para diagnosticar. 13. Se añaden las muestras en cada pozo y ce comienza el corrimiento. El voltaje se ajusta a 120 V hasta que las muestras entren en el gel luego se sube a 200 V, y se corre hasta que se salga el azul de bromofenol (35-40 minutos) Tinción de geles con Azul de Coomassie: 1. Sumergir en la solución colorande Azul de Coomassie y colocar en agitación suave durante 10 -20 minutos.
2. Desteñir en solución decolorante, cambiando está dos o tres veces. 4 Una vez teñido el gel se puede escanear, guardar la imagen y analizar en un software especial que permite determinar el porcentaje de cada fracción de proteínas referido al total de proteínas y cuantificase según la intensidad de las bandas. Qué es la Prueba de Western blot? Es una técnica analítica usada para detectar y localizar proteínas específicas en una muestra determinada. Mediante una electroforesis en gel se separan las proteínas atendiendo al criterio que se desee: peso molecular, estructura,hidrofobicidad, etc. Luego de separarlas en un gel de SDS- poliacrilamida (SDS-PAGE), son transferidas a una membrana adsorbente (típicamente de nitrocelulosa o de PVDF) para poder buscar la proteína de interés con anticuerpos específicos contra ella. Finalmente, se detecta la unión antígeno-anticuerpo por actividad enzimática, fluorescencia…
De esta forma se puede estudiar la presencia de la proteína en el extracto y analizar su cantidad relativa respecto a otras proteínas. Qué se necesita? Las muestras pueden ser tomadas de un tejido entero o de un cultivo celular.
- buffer de extraccion
-Homogenizador
-centrífuga
-Detergentes, sales o tampones
Los materiales deben de estar a bajas temperaturas (4grados) para evitar la desnaturalizacion proteíca. Para separar proteinas de compartimentos y organulos celulares es necesario Combinar tecnicas mecanicas como filtraciones y centrifugaciones.
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