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Expresión de genes reporteros

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by

irene nevarez

on 30 October 2013

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Expresión de genes reporteros



Chaidez Tinoco Xóchitl Guadalupe

Nevárez Lechuga Christian Irene
Díaz Soto José Antonio
7° QBT
Diagnostico Molecular
D.C. Fernando Vázquez Alaníz
Genes reporteros
Son una herramienta esencial en biología, puesto que posibilitan llevar a cabo estudios de detección y regulación de la expresión génica así como de localización subcelular.
Las características particulares de las células en las cuales se pretende cuantificar una determinada expresión génica a menudo permiten, o aconsejan, el uso de un gen reportero con unas propiedades concretas.
Técnicas aplicadas al estudio de la región promotora
En la región promotora se en
cu
entran diversas secuencias o “ca
ja
s” que interaccionan con factores de transcripción. Por lo general, este reconocimiento origina un aumento en la frecuencia, en la cual la RNA polimerasa inicia la transcripción de la región estructural del ge
n
en cuestión
.
En ocasiones, el efecto del reconocimiento entre la secuencia del DNA y el factor transcripcional no es activador sino que reduce la frecuencia de inicio de la transcripción, e
n
cuyo caso se trata de un repres
or.
Sin conocimiento previo sobre estas cajas, es difícil determinar si una variante disminuye o carece de función.
Dado que las “cajas” de control interactúan de manera específica con factores de transcripción en ocasiones el análisis sobre el efecto que tienen cambios de secuencia está limitado por la disponibilidad de sistemas biológicos en los cuales se encuentres estos factores de transcripción..
Esta última aproximación es más asequible si la proteína tiene una actividad enzimática estable y fácil de medir y si no existen isoformas que compliquen la cuantificación de esa actividad enzimática.
Las enzimas que se emplean con más frecuencia como reporteras de la actividad de una región promotora son la β-galactosidasa, (β-gal) o a cloranfenicol-acetil-transferasa (CAT), ambas de origen bacteriano, así como la luciferasa de insectos (Lux), presentes en la luciérnaga.
Una vez que se han detectado diferencias en la eficiencia del promotor de un gen derivado de un paciente es posible definir con mayor detalle el o los cambios de secuencias responsables de las alteraciones en la eficiencia de transcripción por medio de la técnica SSCP o secuenciación directa.
Este
análisis tiene aún una aplicación limitada como
me
todología de diagnóstico molecular, a pesar de que existe una gran variedad de plásmidos comerciales con genes reporteros para el análisis funcional de promotores. Los pasos laboriosos son la clonación de la región promotora, y la caracterización de la construcción resultante, así como el proceso mismo de transfección.
Genes reporteros comunes
Para introducir un gen reportero dentro de un organismo, los científicos colocan el gen reportero y el gen de interés en la misma construcción de ADN (creada artificialmente) para ser insertado dentro de la célula o el organismo
.
Estos genes reporteros son utilizados para probar elementos promotores funcionales, para lo cual el posible promotor es primeramente ligado a la región codificante de un gen reportero para generar un gen, en el cual los elementos regulatorios en estudio controlan la expresión del mismo.
La vía más simple para optimizar los parámetros de transfección es usando un gen reportero. Este permite optimizar la eficiencia de la transfección y medir indirectamente la actividad del promotor, de manera que no es necesario analizar los niveles de ARN y la estructura del ARN producido a partir del gen transfectado
.
Los más utilizados son: el gen que codifica para la β-galactosidasa (LacZ), el gen que codifica la cloranfenicol acetil transferasa (CAT), y el gen bacteriano que codifica para la guanosina-fosforibosil-transferasa (GPT).
La actividad o cantidad del producto del gen reportero es una medida indirecta de las propiedades transcripcionales del ADN testado, generalmente la actividad del gen reportero es directamente proporcional a la actividad transcripcional.
La β-Galactosidasa como gen reportero
Enzima utilizada para la degradación de la lactosa en glucosa y galactosa; esta enzima presenta un peso molecular de 125 KDa. Este gen se ha utilizado frecuentemente en los trabajos de biología molecular, para la identificación de clones recombinantes de E .coli
La cloranfenicol acetil transferasa (CAT) como gen reportero.
La enzima bacteriana cloranfenicol acetil transferasa cataliza la transferencia del grupo acyl del acetil CoA (o cualquiera de los cofactores de AcilCoA) a cloranfenicol.
La β-Galactosidasa es un control interno muy útil para normalizar la variabilidad en la actividad de la proteína reportera debido a la eficiencia de transfección o preparación de extractos celulares.
El gen que codifica para esta enzima no ha sido encontrado en eucariota, por lo que no existe actividad endógena en las células normales de mamífero. Esta característica, unido a la facilidad y sensibilidad del ensayo por la actividad CAT, han hecho de este gen uno de los más ampliamente utilizados para estudios de expresión de genes de mamíferos.
Ensayos de expresión con genes reporteros
Este ensayo se basa en la premisa de que la función de una región promotora puede medirse directamente valorando la cantidad de mRNA recién transcrito o indirectamente, al estimar la cantidad de la proteína codificada.
Gracias por su atención!!! <3
Bibliografia

http://paginas.tol.itesm.mx/Alumnos/A01180982/Guia_Biotec.pdf
Mas Oliva Jaime, Diagnóstico Molecular en Medicina 2° Edición Ed. El manual moderno, México, 2007
Gorman, C.M.; Moffat, L.F. y Howard, B. H. (1982): Recombinant genomes which express chloramphenicol acetyltransferase in Mammalian cells. 2 (9): 1044-1051.


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