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DEGRADACIÓN DE COMPUESTOS FENOLICOS EN EFLUENTES SIMULADOS P

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Jose Melendez

on 30 March 2014

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DEGRADACIÓN DE COMPUESTOS FENOLICOS EN EFLUENTES SIMULADOS POR ACCION DE LA ENZIMA LACASA OBTENIDA A PARTIR EL HONGO
Pleurotus Ostreatus

CAPÍTULO I
EL PROBLEMA

El agua es un recurso natural renovable de gran importancia en el desarrollo de la humanidad (Monge, 2004)
Es utilizada para muchos fines
Industriales
Agrícolas
Ganaderas
Domesticas
Se han desarrollado tecnicas de tratamiento como:
Precipitación
Oxidaciones Químicas
Filtración
Ósmosis entre otras.


Particularmente, en Venezuela, uno de los principales problemas relacionado a los efluentes es la carencia de un tratamiento adecuado, las aguas residuales producto de las grandes ciudades como Maracaibo, Valencia, Maracay, Barquisimeto y Caracas se vierten directamente a las corrientes y ríos como Guaire, Turbio, Neverí así como en los lagos de Valencia, Maracaibo, entre otros, sin haberlas depurado previamente.
Entre los contaminantes quimicos que se pueden encontrar en los desechos industriales se encuentran los fenoles.
Tóxicos para todo organismo que lo metabolice aún en pequeñas cantidades!!!

(Razo, 2003).
Tratamientos desarrollados
Métodos Químicos
Métodos Biológicos
Métodos Físicos
Respecto a las técnicas biológicas usuales, se encuentran la utilización de sepas microbianas, las cuales al incorporarse en el efluente a remediar bajo las condiciones adecuadas crecen en número alimentándose del sustrato contaminado y expeliendo agentes enzimáticos que degradan a los fenoles.
Ventajas
Desventajas
OBJETIVOS DE LA INVESTIGACIÓN
Objetivo General

Evaluar la degradación de compuestos fenólicos en efluentes simulados por acción de la enzima lacasa obtenida a partir del hongo
Pleurotus Ostreatus.

Decreto 883
Demanda de tratamientos convencionales y no convencionales de tratamiento (García, (2006).
Complejo enzimático lacasa (p-difenol: oxigenoreductasa), altamente versátil y considerada degradadora por excelencia y modificadoras de una gran cantidad de sustratos (Dávila y col, 2006)
No obstante, a pesar de las numerosas aplicaciones antes mencionadas, en Venezuela, debido a la pobre inversión en infraestructura adecuada para los procesos biotecnológicos necesarios para la producción de agentes enzimáticos (Saladaña, 2005), la mayoría de estos productos son importados de lugares como los Estados Unidos, Asia o Europa.
Hongo
Pleurotus Ostreatus
productor de enzima lacasa (Suarez, 2012)
JUSTIFICACIÓN
Objetivos Específicos

Cultivar el hongo
Pleurotus Ostreatus
previamente caracterizado, en un sustrato de vinaza de caña.

Determinar la actividad de la lacasa producida por el
Pleurotus Ostreatus
por medio de espectrofotometría de absorción molecular UV.

Evaluar la degradación de compuestos fenólicos variando su concentración y el tiempo de contacto con la enzima lacasa obtenida del
Pleurotus Ostreatus.
Maxima concentracion de fenoles permitida en efluentes 0,5 ppm
Procesos biológicos de tratamiento consisten en degradar determinados compuestos orgánicos contaminantes a través de enzimas, brindando de esta manera una alternativa más amigable con el ambiente
CAPÍTULO II
MARCO TEÓRICO

CAPÍTULO III
MARCO METODOLÓGICO

CAPÍTULO IV
PRESENTACIÓN Y
ANÁLISIS DE
LOS RESULTADOS

CAPÍTULO V
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

Bases Teóricas
Las Enzimas
Hongos
Fermentación
Siendo un Hidrocarburo Aromático (HC), el fenol se deriva de compuestos como el hidroperóxido de cumeno, acido benzoico y cloro benceno (Razo, 2003).
Este compuesto visualmente tiene un aspecto cristalino, de color amarillo o ligeramente rosado, presenta un olor característico dulce y alquitranado.
La reactividad química del fenol es atribuida a su grupo fenilo, que reacciona con bases y ligeramente con algunos ácidos formando diversos productos (International Programme on Chemical Safety o IPCS, 1994).
Petrolera y Petroquímica
Manufactura de compuestos químicos y Desinfectantes
Farmacéutica
Alimenticia
Papelera
Orígenes del Fenol

Tóxicidad del Fenol
Cardiovasculares
Gastrointestinales
Hematológicos
Otros Efectos
Efectos en la Salud Humana
Se ha comprobado que el fenol es un compuesto toxico para la salud humana, animales, plantas y el medio ambiente, debido a la concentración y la presencia de radicales libres (Roy y Popelier, 2008).
Renales
Fenol
Las enzimas son moléculas catalíticas que aceleran la velocidad a la cual una reacción especifica se aproxima al equilibrio químico, estas solo modifican la velocidad de la reacción no su resultado. (Peña, 2004).
Orígenes y características
Naturaleza de las enzimas
Clasificación de las enzimas
Inhibición enzimatica
Que debemos saber sobre las enzimas
Orígen de las enzimas
Hongos
Microorganismos
Animales
Vegetales
Características Generales
Primero, no ocasionan una reacción que no ocurriría por sí sola, pero si hace que ocurra de cientos a millones de veces más rápida.

Segundo, en las reacciones las enzimas no se modifican o se utilizan, ya que la misma molécula enzimática continua trabajando una y otra vez.

Tercero, el mismo tipo de enzima suele catalizar una reacción quimica hacia la derecha y hacia la izquierda cuando esta es reversible

Cuarto, las enzimas escogen a sus sustratos, solo los que constituyen las sustancias específicas que las 18 enzima puede reconocer químicamente son enlazados y modificados de maneras precisas.
Segun Peña (2004)
Se componen de los mismos 20 aminoácidos que se encuentran en las otras proteínas, y adoptan formas características fijadas por la secuencia de los aminoácidos.
Las enzimas que catalizan reacciones similares pueden tener estructuras moleculares sin relación alguna, o pueden, por el contrario, tener estrecha semejanza que indica con toda certeza que proceden de precursores comunes (Peña, 2004).
Estructuras relacionadas
Estructura sin relación
Segun Ortiz, (2008) las enzimas se pueden clasificar en:
Oxidoreductasas:
Son todas aquellas capases de catalizar las reacciones de óxido-reducción
Transferasas:
Catalizan las reacciones de transferencia de radicales o de agrupamiento.
Hidrolasas:
Son aquellas que proporcionan la hidrolisis de diversos tipos de enlaces: éster, acetal (osadico), amida (peptídico)
Liasas:
Enzimas que rompen los enlaces C-C, C-O, C-N, u algún otro, por medios diferentes a la hidrolisis u oxidación.
Isomerasas
Son aquellas que catalizan las reacciones de isomerización cis-trans, o también originan modificaciones intramoleculares
Ligasas o Sintetasas.
Son enzimas que catalizan la reacción de unión de dos moléculas acopladas a la ruptura, sin intervención del agua,
Inhibidores.

Los inhibidores enzimáticos son sustancias que alteran la acción catalítica de una enzima y por consiguiente reducen su velocidad, o en algunos casos, detienen la catálisis. Existen tres tipos comunes de inhibición enzimática; competitiva, no competitiva e inhibición del sustrato.
Inhibición competitiva
Inhibición no competitiva
Inhibición del sustrato
Enzima
lacasa
La lacasa es una de las enzimas, que en los años recientes ha sido ampliamente estudiada. Fue descubierta en exudados del árbol japonés Rhus vernicifera y posteriormente se encontró en hongos como: Pleurotus ostreatus, Pholiota subacida, Trametes versicolor, Rhisoctonia practicola, Aspergillus nidulans y Phanerochaete chrysosporium, entre otros
La lacasa es una oxidasa multicobre, que reduce el oxígeno formando dos moléculas de agua y simultáneamente oxida a varios compuestos aromáticos mediante la abstracción de cuatro electrones (Bourbonnais y col., 1997)

Usos y Aplicaciones
Estabilidad y características de la enzima lacasa
Según Sima (1989) las condiciones de estabilidad para la enzima lacasa son:
Los mediadores son sustancias de bajo peso molecular que amplían la gama de sustratos naturales de las enzimas, extendiendo así el uso de las enzimas a múltiples campos de aplicación. Los mediadores también pueden ser llamados como inductores (Crower y Olsson, 2001) los definen como compuestos que tienen estructuras muy similares o análogas a los sustratos de la enzima y a los componentes de la lignina, los cuales sirven como una señal celular para producir una enzima especifica.
Pleurotus ostreatus
Trametes versicolor
Pholiota subacida
Rhus vernicifera
Aspergillus nidulans
Phanerochaete chrysosporium
Figura 5. Estructura terciaria de la enzima lacasa
Fuente: Claus (2004).
Mediadores de
la enzima lacasa
Rango de pH de 3-10.
Rango de temperatura 5 a 55ºC
Respecto a las caracteristicas de la enzima lacasa según Sima (1989):
La formación de las lacasas amarillas-marrones es el resultado del enlace de moléculas derivadas de la lignina a la proteína de la enzima
Las lacasas pueden ser inducibles o constitutivas y pueden ser extracelulares o intraceluares
El intervalo de pesos moleculares de la lacasa pueden variar desde 65000 y 140000 Da
Se han definido en base a sus características como eucariotas, es decir poseen núcleo estructural con membrana nuclear.
Son capaces de formar tejidos y presentan un cuerpo denominado talo que puede ser unicelular o pluricelular. En este último caso tiene el aspecto de tubos cilíndricos con células encolumnadas y produce ramificaciones hasta construir un desarrollo macroscópicamente visible.
En cuanto a la reproducción de los hongos se produce por la formación de esporas, que son células uninucleadas o multinucleadas destinadas a la diseminación y propagación de la especie a distancia.
Otra característica general importante de los hongos es que carecen de clorofila y, por tanto, son heterótrofos, es decir que necesitan vivir sobre sustancia orgánica viva o muerta; en el primer caso son parásitos y en segundo, saprobios.
Hongos de pudrición blanca
Microorganismos que atacan la madera degradando profunda y completamente los componentes lignocelulósicos. Actualmente se conoce que los hongos de pudrición blanca están implicados en la degradación de la mayoría de las estructuras químicas que componen la madera incluyendo la celulosa, aunque la lignina es el principal compuesto degradado (Rayner, 1988)
Usualmente la madera se vuelve blanquecina debido al blanqueamiento producido por la oxidación y a la perdida de lignina, la cual es ligeramente café. El color y la textura dependen del hongo causante de la pudrición, como ejemplo de los hongos que causan la pudrición blanca están Phanerochaete chrysosporium y Pleurotus ostreatus (Martínez, 2006).
Pleurotus Ostreatus
Es un hongo comestible comúnmente conocido como falsa seta de cardo, caracterizados por ser un hongo de pudrición y descomposición de la madera (Agrario, 2002).

Por lo general son fáciles de identificar por sus cuerpos fructíferos altamente organizados, características que le da importancia económica tanto en la rama biotecnológica como alimenticia (Jagnow y col., 1991).
La fermentación es un término derivado del verbo en Latín fevere, que significa hervir. Este fenómeno fue luego asociado con la espontanea conversión de substratos a bebidas alcohólicas; en las cuales, el catabolismo anaeróbico del azúcar debido a la levadura produce burbujas de dióxido de carbono.
Según Sánchez, (2008), la fermentación se clasifica en dos tipos generales basada en el requerimiento de oxigeno:
Tipos de Fermentación
Aeróbica
Anaeróbica
Fermentacion en estado sólido (SSF)
Naturaleza de la Investigación
Manipulación de Variables
Evaluar lo que sucede
Una investigación experimental
Independientes
Concentración de la enzima lacasa obtenida del hongo
Pleurotus Ostreatus
.

Concentración inicial del fenol en muestras acuosas

Tiempo de contacto del agua sintética y la enzima.
Dependiente
Concentración final de fenol en agua sintética luego de la aplicación de la enzima lacasa obtenida del hongo
Pleurotus Ostreatus
a valores de concentración y tiempo de contacto determinados.
Procedimiento Experimental
Semillas de trigo infectadas
con el micelio del hongo

Clínica de Diagnosis de Fitopatología y Nematologia de la Universidad Nacional Agraria la Molina, ubicada en Lima-Perú.
Obtención del Hongo
Pleurotus Ostreatus
Preparación de medio de Cultivo
Recolección del sustrato Vinaza de Caña
En las instalaciones de la destilería Yaracuy C.A.
Medio de cultivo Agar-Vinaza-Indicador
80 g de Agar PDA
750 mL de Agua destilada
250 ml de Vinaza
5 mL de Catecol al 10%
Permanecer a fuego lento por 20min
Esterilizar

Acondicionamiento del Sustrato
Filtrar
Ajuste de pH a 4 y °Brix a 5
Esterilizar en autoclave por 15 min a 121°C y 15psi
Solución Tampón Citrato-Fosfato
Solución A
1,5601 g de Fosfato ácido de Sodio ( ) al 98 % en 50 ml de agua des ionizada
Solución B
7,1828g ácido cítrico ( ) al 99,5 % en 100 mL de agua des ionizada
48,75 ml A + 76,25 ml B + 375 ml Agua Des = 500ml TCP (pH= 4)
Siembra en el medio de cultivo
Ambiente de Asepsia
6 micelios del hongo en zona central de la placa
Llevar a incubación por 10 días a 27-28 °C
Caracterización del Hongo
Pleurotus Ostreatus
Microscopio
Porta Objetos
Gómez, (2009).
Estructuras observadas en la caracterización microscópica del hongo
Pleurotus ostreatus.

Hifas
Hifas con Septos
Hifas con Núcleos
Fíbulas
Determinación enzimática
Cualitativo

Cuantitativo
Halo Marrón rojizo
Oxidación Lacasa- catecol
Prueba de la gota con ABTS
Kunamneni, 2008
Disolvió en 10 mL de TCF y filtró por succión
Se extrajeron rectángulos de los diferentes cultivos
50 microL Solución de Enzima
950 microL ABTS
Blanco: TCF y ABTS
Se determinó la absorbancia a 420 nm a los tiempos de 10, 20, 30, 60 y 80 min en espectrofotométro Genesis.
Ensayo se realizó por duplicado para cada muestra
Concentración

LEY DE LAMBER- BEER
Actividad
Preparación de Solución enzima fenol
Soluciones de Fenol
100 ml Solución
50 ppm

90% v/v de fenol
Agitación
2Horas
50 mL
0,5 ppm
1 ppm
4 ppm
8 ppm
Decreto 883
Vertido de Efluentes
Valor experimental
Residual de Refinería (Meza, 2007)
Efluente Agroindustrial (Ferrer y col, 2012)
Extracto Enzimático
Disolvió la totalidad de cada cultivo en 200ml de TCF
Filtró por succión y se refrigeró
Enzima

Fenol
0,5, 1, 4, 8 ppm
12 ml
20 ml
Por duplicado resultando en 24 muestras
8 a evaluar por 1 hora
8 a evaluar por 2 horas
8 a evaluar por 24 horas
Determinación concentración final de fenoles
Método colorimétrico usando el reactivo de Folin-Ciocalteu
Mezcla de Tungstatos y molibdatos
Cromógeno
Absorbe Luz a 700 nm
Preparación de curva de calibración
Lectura de Absorbancia a 700 nm
Tratamiento de muestras
Tomaron 25 ml de sol enzima- fenol
Agregaron 1.5 ml de reactivo F-C más 2 ml de sol Carbonato de Sodio (20%)
Medió Absorbancia a 700 nm
Interpoló de la curva de calibración para conocer Cf
Calculó el porcentaje de Degradación
Servir Agar PDA-Vinaza Catecol en
Capsulas Petri
Reacción redox
En medio Básico reacciona con los compuestos fenólicos

Khilifia, 2010
Molainen, 2010
Castillo, 2011
Chea, 2012
Decolourization and detoxification of textile industry wastewater by the laccase-mediatorsy
Decolorization of simulated textile dye baths by crude laccases from Trametes hirsute and Cerrena unicolor
Degradación de compuestos estrogénicos por medio de la Lacasa de Trametes Versicolor
Aplicación de un Reactor de Membrana Enzimática (REM) para la degradación de compuestos fenólicos
Estudió la decoloración y desintoxicación de un efluente de la industria textil usando la enzima lacasa del hongo Trametes Versicolor
Sólo decoloró menos del 10% usando solo la enzima en 9 mezclas de reacción
Probó la acción de varios mediadores de la lacasa a concentraciones de 0 a 1mM
Concluyó que el mediador más efectivo para decolora el efluente fue el 1-hodroxibenzotriazol (HBT)
Usó las lacasas crudas obtenidas a partir de hongos de pudrición blanca Cerrena unicolor y Trametes hirsuta, por su capacidad para decolorar baños simulados de tinte textil
Los colorantes utilizados fueron Remazol Brilliant Blue R (RBBR) (100 mg / L), Rojo Congo (12,5 mg / L), Lanaset gris (75 mg / L) y Poly R-478 (50 mg / L)
El resultado fue que la lacasa del Cerrena unicolor fue capaz de decolorar todos los colorantes ensayados y además fue especialmente eficaz para rojo Congo y RBBR con 91 y 80% de eliminación del color en 19,5 h a pesar del hecho de que los baños de tinte textil utilizados fueron simulados.
Evaluó la capacidad de la enzima lacasa del hongo Trametes Versicolor para degradar estradiol
Usó un agua residual de origen urbano
Empleó la enzima inmovilizada sobre una membrana de cerámica.
Logró degradar 80% del estradiol contenido en el agua residual
Evaluó la degradación de compuestos fenólicos con la enzima Lacasa inmovilizada en una membrana enzimática
Usó un pH de trabajo cercano a 4 y una temperatura de operación entre 15 y 40 °C
Degradó hasta un 90% de compuestos fenólicos y además concluyo que la temperatura a la cual pueden tratarse estos efluentes es de 25 °C.
El cultivo del hongo
Pleurotus Ostreatus
, se desarrolló de forma satisfactoria usando un medio de PDA-Vinaza-Catecol, encontrándose un máximo desarrollo micelar a los 10 días de incubación con oscurecimiento del medio de cultivo producto de la oxidación Lacasa-Catecol.
ANTECEDENTES
A través de la técnica instrumental espectrofotométrica, se evaluó la actividad de cinco cultivos (C8-04, C8-08, C8-10,C8-12, C8-14), usando ABTS como agente oxidante, de los cuales dos fueron descartados (C8-12, C8-14) debido a presentar comportamiento erróneos en tendencia de actividad de la enzima en el tiempo, los tres restantes mostraron comportamiento creciente - decreciente, alcanzando un máximo de actividad a los 60 minutos de reacción, no obstante, el cultivo C8-10 presento la mayor actividad siendo esta de 3,8565 U/L a los 60 min, mientras que el cultivo C8-08 con un valor de 2,9028 U/L se ubicó como el de menor actividad. A pesar de que todos los cultivos fueron realizados bajos las mismas condiciones, dicha variación de actividad puede atribuirse al metabolismo del microorganismo el cual, pudo no obtener la energía suficiente para su desarrollo a través del proceso fermentativo y por consiguiente la segregación de enzima, además de que no fue posible controlar las condiciones de desarrollo iniciales de cada uno de los micelios plantados presente en las semillas antes de ser cultivadas
La evaluación de la degradación de fenol se llevó a cabo de forma satisfactoria, usando para ello cada extracto crudo del cultivo previamente obtenido, en el cultivo C8-04 se alcanzó un promedio de degradación de 73,75 por ciento a una hora de tiempo de contacto, la placa C8-8 logró degradar en promedio un 78,5 por ciento del fenol presente en el agua sintética a dos horas de tiempo de contacto y por último el cultivo C8-10 degradó un promedio de 96,5 por ciento del fenol. Encontrándose estos porcentajes de remoción dentro de los valores reportados para la degradación de compuestos fenólico por acción de la lacasa en investigaciones previas
En líneas generales se puede establecer que la degradación de compuestos fenólicos usando el extracto crudo de la enzima lacasa que produce el hongo Pleurotus Ostreatus fue satisfactoria, lográndose descomponer a diferentes intervalos de tiempo de contacto desde un 75 por ciento hasta 96 por ciento del fenol presente en el agua. Sin embargo, el cultivo C8-04 puede seleccionarse como el más efectivo, ya que a pesar de presentar una actividad de magnitud intermedia en comparación con los cultivos C8-08 y C8-10 logró una degradación de 73,75 por ciento en el menor tiempo de residencia (1 hora).
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Evaluar el porcentaje de degradación de compuestos fenólicos con la enzima del hongo
Pleurotus Ostreatus
, previamente separa y purificada.

Evaluar la degradación compuestos fenólicos a través de la inmovilización de la enzima obtenida del Pleurotus Ostreatus en un reactor de membrada enzimática, tal como lo establece Chea. V (2012).

Variar el pH y temperatura de las aguas sintéticas a fin de evaluar el porcentaje de degradación con el extracto crudo de la enzima Lacasa del hongo
Pleurotus Ostreatus
.

Aumentar la actividad de la enzima mediante la incorporación de iones cobre (Cu+) en el medio de cultivo, incrementándola más de 67 veces, según Preessler, C (2012).




Usar un efluente real de la agroindustria o refinería, que contenga otros compuestos fenólicos como dimetoxifenol, orto-fenol, para-fenoles y diversos poli-fenoles.

Análisis de DBO Y DQO luego de la aplicación de la enzima lacasa proveniente del hongo
Pleurotus Ostreatus
en un efluente industrial real.
Recibido 20-03-2014.
Generó un micelio Aéreo, algodonoso y de color blanco, resultado similar al establecido por Acosta y col., (1994).
Cultivo del Hongo
Placa C8-04
Placa C8-08
Placa C8-10
Evaluación de Actividad
Brooks y col., (2012) estable

“En el curso de una reacción enzimática se mide la cantidad de sustrato que se consume o produce, siendo dicho consumo de crecimiento rápido al comenzar la reacción alcanzándose un punto de alta actividad y, posteriormente, ocurre la desnaturalización producto de la posible inestabilidad de la enzima”.
Comportamientos similares a las investigaciones realizadas por Cano, (2010) y Majarrés, (2009).
1 Hora de Contacto
2 horas de Contacto
24 horas de Contacto
Evaluación de la degradación
El incremento en el porcentaje de degradación a mayor concentración de sustrato (fenol), es acorde con lo establecido en el Manual of Clinical Enzyme Measurements de Worthington Biochemical Corporation (1972), el cual afirma que;

“Se ha demostrado experimentalmente que si la cantidad de enzima (E) se mantiene constante y la concentración del sustrato (S) es gradualmente incrementada, la velocidad de reacción se incrementará hasta alcanzar un máximo. Después de este punto, el incremento de la concentración del sustrato no incrementará la velocidad. Teóricamente, cuando la máxima velocidad ha sido alcanzada toda la enzima disponible ha sido convertida al complejo sustrato-enzima (ES)”
Sánchez, (2013)
Los valores promedio de actividad a 10 minutos fue de 0,6667 U/L, por su parte Suarez, (2012), obtuvó un actividad promedio de 0,0442 U/L.
Lab. de Procesos Agroindustriales
UCLA- Agroindustrial
Lab. Microbiología
UCLA- Agroindustrial
Lab. Química Analítica
UCLA- Agroindustrial
Lab. Análisis Instrumental
UNEXPO
TESTIGOS
A concentraciones de 0,5, 1, 4, 8 ppm de fenol
Lab. Análisis Instrumental
UNEXPO
Técnicas Microbiológicas
Lab. Análisis Instrumental
UNEXPO
Entre las aplicaciones mas usuales de la lacasa se encuentran la suavización de la masa del pan, romocion de tintes en agua, blanquedo de textiles y papel y producción de bebidas alcohólicas
Estructuras visibles microscópicamente del
pleurotus ostreatus.
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