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PRESENTAZIONE TESI

MAPT
by

Andrea Zeni

on 5 April 2016

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Transcript of PRESENTAZIONE TESI

microRNA implicati nella
regolazione post-trascrizionale
di
MAPT

Laureando: Zeni Andrea

Relatore: Denti Michela A.
Tutor: Grasso Margherita

-atrofia selettiva dei lobi frontali e temporali
- perdita neuronale e gliosi (proliferazione astrociti)
-perdita di memoria e empatia
-difficoltà nel comunicare
Degenerazione Lobare Fronto-Temporale (FTLD)
MAPT
codifica per la proteina TAU
-ruolo nell' assemblaggio
e nella stabilità dei microtubuli
-crescita assonale
-polarità assonale
-COMPONENTE GENETICA
-MUTAZIONI DEL GENE
MAPT
(CHR.17)
NEL NOSTRO STUDIO CI SIAMO
SOFFERMATI SULL A FTDP-17 OVVERO DEMENZA FRONTOTEMPORALE CON PARKINSONISMO
ASSOCIATA AL CROMOSOMA 17 (SOTTOCLASSE DELLE FTD)
MAPT
TAU

-Singolo filamento: 18-25 nucleotidi
-Funzione principale: regolazione
post-trascrizionale mediante il legame
al 3'UTR di mRNA bersaglio
-Piccole molecole endogene di
RNA non codificante
miR
-Agiscono da regolatori negativi:
Scopi dello Studio
-PREDIZIONI BIOINFORMATICHE

- CLONAGGIO DI 8 FRAMMENTI del 3'UTR DI
MAPT
A VALLE DELLA LUCIFERASI NEL VETTORE pGLO (Promega)

-ANALISI DEI LIVELLI BASALI DELL' ATTIVITA' LUCIFERASICA DEI VARI COSTRUTTI

-TRASFEZIONE IN CELLULE
HeLa
DEL PLASMIDE OVERESPRIMENTE i miR e CONFERMA DELL' EFFETTIVA OVERESPRESSIONE MEDIANTE qRT-PCR

- VALIDAZIONE DELL'INTERAZIONE TRA miR e 3'UTR di MAPT
TRAMITE SAGGI DI LUCIFERASI E WESTERN BLOT
Overespressione
-Overespressione mediante l’utilizzo del plasmide psiUx (Denti M.A. et al., 2004).

-Clonaggio della regione genomica corrispondente al precursore del miR all' interno del promotore e terminatore del piccolo RNA nucleare U1 (U1 snRNA)
Predizioni
Bioinformatiche
Gene Ontology
Clonaggio di 8 frammenti del
3'UTR di
MAPT
in vettori pGLO
Trasfezione
Validazione Reporter
La GO è un progetto bioinformatico che cerca di unificare la descrizione delle caratteristiche dei geni in tutte le specie con lo scopo di sviluppare una descrizione coerente dei geni e dei loro prodotti fra i differenti database.
HOCTAR è uno strumento che permette di integrare le predizioni bioinformatiche e i dati di trascrittomica
per trovare target putativi dei miR.
Tramite l'utilizzo di Targetprofiler si è cercato di valutare quali miR potessero essere utilizzati per gli esperimenti
-Un algoritmo probabilistico di tipo machine learning
validato con l'utilizzo di dati di down regolazione di proteine
Esempio output di
Targetprofiler
Corsa elettroforetica dei frammenti in seguito a doppia digestione dei costrutti eseguita con opportuni enzimi di restrizione.
pGLO-MAPT-1-2-3-4-5-6-7-8

-
HeLa
cellule tumorali immortalizzate della cervice uterina
-Poco espresso miR608
Verifica efficienza trasfezione
Tali® Image Cytometer permette di verificare l’efficienza della trasfezione andando a valutare l’espressione della GFP, infatti è proporzionale alla quantità di fluorescenza emessa
LIPOFECTAMINE LTX
24h --> 70%
48h --> 80%
Sono stati trasfettati 50ng dei costrutti
pGLO-MAPT-1-2-3-4-5-6-7-8

Le cellule trasfettate sono poi state utilizzate
per il successivo saggio di luciferasi
Estrazione dell' RNA



L’RNA totale è stato estratto con protocollo TRIZOL e analizzato
con il Bioanalyzer 2100 Agilent che fornisce un indice di qualità (RIN)
che può variare da un minimo di 1 (RNA degradato ) ad un
massimo di 10 (RNA integro)
11 su 12 dei campioni --> RIN tra 8-10

1 campione --> RIN non rilevabile
qRT-PCR
L’RNA è stato poi amplificato mediante Real Time PCR quantitativa per individuare e quantificare il miR di nostro interesse. Per normalizzare l’espressione del miR è stato utilizzato il piccolo RNA nucleare U6.

qRT-PCR eseguita per valutare overespressione del miR608 a 24h e 48h nel saggio di Luciferasi
qRT-PCR eseguita per valutare overespressione del miR608 a 48h nel WB
I valori di attività luciferasica risultano essere confrontabili
tra i vari frammenti tendendo ad aumentare alle 48h
Western Blot
Conclusioni
Ringraziamenti
’' Vi è un solo mezzo per far progredire la scienza: dar torto alla scienza già costituita.’’

[cit.] Gaston Bachelard


GRAZIE PER L'ATTENZIONE
Validazione dell'
interazione tra il miR 608
e il 3'UTR di
MAPT

24h
48h
In questo caso l’effetto del miR608 rimane pressochè stabile sul 3’UTR INTERO mentre l'effetto diminuisce
significativamente sul frammento 5 (20%)
se confrontato con le 24h
Per verificare se il livello di espressione della proteina
TAU endogena è stata influenzata dal trattamento con
i miR si è eseguito un Western Blot
Le cellule trasfettate con il miR 608 mostrano un
30% di riduzione dei livelli proteici di
TAU endogena se normalizzati rispetto
al vettore vuoto (E)
ANALISI DENSITOMETRICA
Il miR 608 sembra avere un ruolo importante
nel regolare il 3'UTR di
MAPT
:

- PREDIZIONI BIOINFORMATICHE

-CLONAGGIO DI 8 FRAMMENTI del 3'UTR DI
MAPT
A VALLE DELLA LUCIFERASI NEL VETTORE pGLO

-VALIDAZIONE DELL'INTERAZIONE TRA miR 608 e
3'UTR di
MAPT
:

- CONFERMA OVERESPRESSIONE miR 608

- SAGGI DI LUCIFERASI e WESTERN BLOT: abbassamento dell'attività luciferasica
e del livello proteico di TAU endogena

Anticorpo Monoclonale --> Rilevazione 2 isoforme
Peso Molecolare --> 55KDa
Bande quantificate --> analisi densitometrica
Normalizzatore --> gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi(GAPDH)
Laboratory of RNA Biology and Biotechnology della Dott.ssa Michela Alessandra Denti


Margherita e Francesca

Mamma, Papà e Elisa

Viola

Nonni


Tutti quelli che hanno sostenuto in questi anni compresi tutti i miei amici.....


...GRAZIE A TUTTI
DEGRADAZIONE DIRETTA mRNA
REPRESSIONE TRADUZIONALE
ANALISI DEI miR COINVOLTI NELLA REGOLAZIONE
POST TRASCRIZIONALE DEL 3' UTR DI
MAPT


- Dalla validazione risulta che Targetprofiler
esegue predizione più accurate rispetto ad
altri tool bioinformatici
miR 608--> Scelto in base alla Free Energy
L’attività luciferasica di Firefly e Renilla
(normalizzatore) sono state determinate
a 24h e 48h
Analisi dei livelli basali dell'attività luciferasica
-WESTERN BLOT
PER I SUCCESSIVI ESPERIMENTI è STATO SCELTO
IL FRAMMENTO 5 CONTENENTE UNO DEI
SITI DI LEGAME PER IL miR608
Validazione dell'
interazione tra il miR 608 e
il 3'UTR di
MAPT
L’effetto del miR 608 sia sul 3’ UTR INTERO che sul frammento 5
risulta essere netto: il miR 608 è in grado di down-regolare l’attività luciferasica.

Come si può vedere dal fold change (ottenuto normalizzando
sull’ EMPTY) l’effetto è pari a circa il 50% sul frammento 5,
e al circa il 30% sul 3’UTR INTERO
SAGGIO di LUCIFERASI

E --> Controllo negativo
FR2 --> Controllo negativo
E --> Controllo negativo
FR2 --> Controllo negativo
Prospettive future
- Riconferma dei risultati del WB

-qRT-PCR sul RNA messaggero di
MAPT

-Linea cellulare più appropriata --> linea neuronale

-Mutagenesi sito specifica

-Studio di un miR diverso come il miR 939
che lega la regione codificante di
MAPT
Ci sono però molti meccanismi che potrebbero portare ad un
accumulo
, al misfolding e/o ad un'errata
localizzazione della proteina TAU

La maggioranza dei casi di FTDP-17 sono
sporadici causati da una combinazione
di fattori di rischio genetici e ambientali
e legati all'invecchiamento


WESTERN BLOT
Validazione dell'
interazione tra il miR 608 e
il 3'UTR di
MAPT
-SAGGIO di LUCIFERASI
Baker et. al., Nature 2006
Protein Data Bank
Kato et al., Clin J Am Soc Nephrol 2009
http://mirna.imbb.forth.gr/Targetprofiler.html
Oulas A. et al., RNA Biol 2012
CUMULATIVE SCORE - Aspetto Biofisico
-Aspetto Filogenetico
= duplex - open

Gennarino VA, et al. Gene 2011
Dati di partenza
-CLONAGGIO 3'UTR
MAPT
INTERO IN pGLO
-SAGGIO DI LUCIFERASI
-EFFETTO NON SIGNIFICATIVO DEL miR 608
sul 3'UTR DI
MAPT
DIVISIONE DEL 3'UTR di
MAPT
IN 8 FRAMMENTI
VETTORE
INSERTO
1 replicato biologico, 3 replicati tecnici
4 replicati biologici, 2 replicati tecnici
1 replicato biologico, 1 replicato tecnico
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