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Ensaio Mtt

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by

eleonora carvalho

on 10 October 2012

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Transcript of Ensaio Mtt

Ensaio MTT Conceitos Protocolo Formação dos cristais de Formazan Reação da redução do MTT Esse método avalia a viabilidade celular que se baseia na capacidade das células viáveis reduzirem metabolicamente o sal de MTT ([3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)2,5-difenil brometo de tetrazolium). O sal de MTT é um composto hidrosolúvel, que em solução apresenta coloração amarelo-pálido, e é facilmente incorporado pelas células viáveis, que reduzem esse composto em suas mitocôndrias através da enzima desidrogenase succínica. As desidrogenases estão associadas ao NADPH e ao NADH. Ao ser reduzido o MTT é convertido em cristais de formazan, um composto de coloração azul-escuro, não solúvel em água e que fica armazenado no citoplasma celular. Reagentes e soluções Método 0.5 mg/ml MTT = 0.5 mg/ml MTT em DMEM. Essa pode ser preparada de 5 mg/ml de solução estoque em DMEM armazenadas como alíquotas congeladas a – 65°C.

HBSS = solução salina equilibrada de Hank.
1.Remova o meio e lave os poços com 100 µl de HBSS. Não use PBS para lavar.

2.Adicione 100 µl/poço de MTT a 0,5 mg/ml. Solução de MTT também deve ser adicionada a alguns poços que não contenham células para servir como padrão/ referencia.

3.Incube a 37°C , 5% CO2 por 2-3h. Pare a incubação se os controles não tratados aparentarem estar bem corados no tempo de 2h (examine no microscópio usando um campo de iluminação claro). Incubações longas são prejudiciais às células e podem causar a soltura e separação dessas da placa.

4.Remova a solução MTT e cuidadosamente borre os poços batendo a placa em uma toalha de papel. Não bata muito forte pois algumas células podem ser perdidas neste momento se elas começarem a se soltar da placa.

5.Adicione 100 µl de DMSO, deixe descansar por 1-2 minutos, em seguida agite no shaker por 1-2 minutos e leia o OD a 550nm e 690nm.

6.Subtraia OD690nm do OD550nm para todos os poços a fim de se obter o correto OD a 550nm (OD550).

7.Calcule a % de viabilidade para cada condição de tratamento em relação as células não tratadas como condição de 100%.
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