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tecnicas histologicas y microscopia

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Fran Nunez

on 4 February 2015

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Transcript of tecnicas histologicas y microscopia

histologia
Es la disciplina que estudia la organización microscópica de los seres vivos y lamanera en que se interrelacionan, estructural y funcionalmente, sus componentes individuales. Etimológicamente,se define a la Histología como la disciplina que se ocupa del
estudio de los tejidos
.
tecnicas histologicas
y microscopia

En otras palabras histología
es sinónimo de
“anatomía microscópica”

generalidades de las tecnicas usadas en histologia
las técnicas utilizadas por los histólogos son diversas en extremo.
Preparacion del tejido
Los pasos para la preparación de un tejido son
:

OBTENCION DE LA MUESTRA
FIJACION
DESHIDRATACION
INCLUCION
COLORACION
Obtencion de la muestra
Se puede obtener la muestra por varias formas;

1.Biopsia; tejido vivo.
2.Autopsia; tejido muerto.
3.Necropsia; tejido podrido - necrosado.

FIJACION
El propósito es CONSERVAR el protoplasma con el menor grado de alteración posible. Evita la autolisis por enzimas liberadas por el propio tejido.

Unos de los Fijadores mas comunes es la formalina al (37%)

Deshidratacion
Luego después de la fijación, se lava y deshidrata la muestra en una serie de soluciones alcohólicas de concentración creciente hasta llegar al 100%.

Después de eso, se utilizan solventes como el xileno o tolueno para extraer el alcohol al 100%

Inclusion
Incluir la muestra en la parafina fundida a 60 grados.
Luego después que la parafina se ha enfriado y endurecido se obtendrá un bloque denominado taco.
Se coloca el taco en una maquina denominada micrótomo, que se encargará de hacer cortes de 5 a 15 µm (micras) (1 micra equivale a milésima parte de 1 milímetro)

coloracion o tincion
Después de los cortes hay que hidratar la muestra con una serie de soluciones alcohólicas en porción decreciente para que se pueda colorear con hematoxilina (color azul) y después otra vez deshidratar con una serie de soluciones alcohólicas en porción creciente para que se pueda colorear con eosina (color rosa).
OTROS FIJADORES
LA FORMALINA NO PRESERVA TODOS LOS COMPONENTES DE LAS CELULAS Y TEJIDOS
POR ESTO SE UTILIZAN OTROS FIJADORES ESPECIALES.
OTRAS TECNICAS DE TINCION
LA HEMATOXILINA Y LA EOSINA SE UTILIAN EN HISTOLOGIA PRINCIPALMENTE PARA PONER EN EVIDENCIA LAS CARACTERISTICAS ESTRUCTURALES
HISTOQUIMICA Y CITOUIMICA
FUNDAMENTOS QUIMICOS DE COLORACION
COLORANTES ACIDOS Y BASICOS
La hematoxilina y la eosina son los colorantes de uso mas frecuentes en la histología
Un
colorante acido como la
eosina tiene una carga
negativa
en su parte coloreada y se describe
con la formula general
( Na+ anilina- )
Un colorante basico tine una carga neta positiva en su parte coloreada y se describe con la formula general
( anilina+ CL- )
los colorantes basicos reaccionan con los componentes anionicos de las celulas y los tejidos
( coponentes que tienen una carga neta negativa )
colorantes basicos
verde metilo
azul metileno
pironina G
azul de toluidina
color
verde
azul

rojo
azul
colorante
acido
fuscina acida
azul de anilina
eosina
naranja G
color
rojo
azul
rojo
naranja
los colorantes acidos reaccionan con los grupos
cationicos de las celulas y los tejidos en particular
con los grupos amino ionizados de las proteinas
Una cantidad limitada de sustancias dentro de las celulas y en la matriz extracelular presentan basofilia.

Heterocromatina y nucléolos
Componentes citoplasmáticos
Material extracelular
La tiencion con colorantes acidos es menos especifica pero mas sustancias dentro de las celulas y en la matriz extracelular presentan acidofilia.

filamentos citoplasmáticos
componentes membranosos intracelulares
fibras extracelulares
Ciertos colorantes basicos reaccionan con componentes histicos que hacen cambiar su color normal del azul al rojo o al purpura; esta modificacion de la absorbencia se denomina metacromasia
GRUPOS ALDEHIDO Y EL REACTIVO DE SCHIFF
PAS
GRUPOS ALDEHIDOS =
OH
-NH
2
MICROESPETROFOTOMETRIA DE FEULGEN
Aumento de DNA en las Células
Ploidea
Cantidad de veces que esta multiplicada el DNA.
Microespectrofotometría de Feulgen
CELULA
DIPLOIDE
HAPLOIDE
CUANDO
NO
ESTA
DIVIDIDA
OVULO

ESPERMATOZOIDE
Para cuantificar el DNA se utilizan dos técnicas:

- Citometría Estética:
Para cortes de tejido.

- Citometria de Flujo:
Para células aisladas.
HISTOQUIMICA ENZIMATICA
Las técnicas histoquímicas también se utilizan para identificar enzimas en células y tejidos.

Para localizar enzimas en los cortes histológicos debe tenerse especial cuidado durante la fijación para que se preserve la actividad enzimática.

En una reacción típica para detectar una enzima hidrolítica, el corte histológico se coloca en una solución que contiene un sustrato (AB) y un agente de atrapamiento (T) que precitará uno de los productos como sigue:

AB + T AB + B

EMZIMA
INMUNOCITOQUÍMICA

El fundamento de la inmunocitoquímica es la especificidad de la reacción entre un antígeno y un anticuerpo.


LUZ ULTRAVIOLETA


Anticuerpos Policlonales

Estos son producidos por animales inmunizados. Son mezclas de anticuerpos diferentes producidos por muchos clones de linfocitos B en la que cada clon reconoce una región diferente de la molécula de actina.

Anticuerpos Monoclonales

Son los sintetizados por una línea celular productora de anticuerpos compuesta por un solo grupo (clon) de linfocitos B idénticos.

Para localizar un antígeno diana en células y tejidos se utilizan métodos inmunocitoquímicos tantos directos como indirectos.




Es el conjunto de técnicas y métodos destinados a hacer visible los objetos de estudio que por su pequeñez están fuera del rango de resolución del ojo normal. Si bien el microscopio es el elemento central de la microscopía.



La microscopia

Un microscopio simple (de una sola lente) o compuesto (lentes múltiples), es un instrumento que aumenta el tamaño de una imagen y permite ver con detalles lo que seria imposible ver a simple vista.


La función del microscopio es ampliar la imagen hasta un grado en que la retina pueda resolver la información que estaría fuera del límite de resolución.

Microscopios






La resolución depende de la longitud de onda de la luz y de otros factores:

El espesor de la muestra.

La calidad de su fijación.

La intensidad con la que esta teñida

Es la capacidad de una lente o un sistema óptico del microscopio de producir imágenes separadas de objetos que están muy cerca uno del otro.

La lente ocular aumenta la imagen producida por la lente del objetivo, pero no puede aumentar la resolución.


La resolución



La diferencia para los diversos microscopios ópticos para investigaciones biológicas radica entre los principales factores:

La longitud de onda con la que se ilumina.

La alteración física de la luz.

Los procesos analíticos específicos que pueden aplicarse a la imagen final.

Diferencia o factores de diversos microscopios ópticos



Los principales componentes del microscopio de campo claro son:

Fuente luminosa: para la iluminación de la muestra.

Lente condensadora: enfocar el haz de la luz y la altura de la muestra.

Platina: sobre la que se coloca el portaobjetos.

Lente objetivo: recoge la luz que atraviesa la muestra.

Lente ocular: se examina la imagen formada por el lente objetivo (los binoculares un par de lentes oculares en los microscopios son de uso más común).



Microscopio de campo claro.


examen de un preparado histologico con un microscopio optico
USO CORRECTO DEL MICROSCOPIO ÓPTICO

MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE BARRIO

MICROSCOPIO ÓPTICO

MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE TRANSMISIÓN

Diferentes tipos de microscopio

5 consejos para un uso correcto del microscopio óptico

Otros sistemas opticos

Ademas del micoscopio de campo claro, que se usa habitualmente para el examen de rutina de los preparados histologicos , en los laboratorios clinicos y de investigacion se aplican otros sistemas opticos como son: El microscopio de contraste de fase y el microscopio de flurescencia y confocal.

El microscopio de contraste de fase permite el examen de celulas y tejidos no teñidos y es especial utilidad para estudiar celulas vivas.

Miscroscopio de contraste de fase

En este microscopia de campo oscuro la lente objetivo no capta luz directa proveniente de la fuente luminosa.
En el microscopio de campo oscuro solo los rayos de luz refractados por las estructuras de la muestra penetran en el objetivo.



microscopio de campo oscuro

EL microscpio de fluorescencia aprovecha la capacidad de ciertas mleculas de fluorescer bajo la luz ultravioleta.


Microscopio de fluorescencia

El microscopio confocal de barrido combina componentes de un microscopio optico de campo claro con un sistema de barrido para disecar ópticamente una muestra.
El microscopio confocal de barrido permite la visualización de una muestra biológica en tres dimensiones

Microscopio confocal

el microscopio de luz ultravioleta utiliza lentes de cuarzo con una fuente de luz ultravioleta. La imagen de este depende de la absorción de la luz ultravioleta por las moléculas de la muestra.
el microscopio de luz UV es útil para detectar ácidos nucleicos, en especial las purinas y las pirimidinas que son las base nitrogenadas de los nucleótidos .

Microscopio de luz ultravioleta

El microscopio de polarización o de luz polarizada es una simple modificación del microscopio óptico de campo claro en la que se coloca un filtro un filtro de polarización o filtro polarizador, entre la fuente luminosa y la muestra y se instala un segundo filtro, llamado el analizador, entre entre la lente objetiva y el observador.

Microscopio de polarización

Es una tecnica de estudio de imagenes a gran aumento que usa haces de electrones para analizar morfologicamente celulas y tejidos.

Microscopia electronica

Consiste basicamente en un haz de electrones que atraviesan la muestra.

Microscopio electronico de transmision

Mitocondria obtenida por microscopio electronico de transmision.

Criofractura

Como su nombre lo indica este barre toda la superfucie con el haz de electrones.

Microscopio electronico de barrido

Imagen obtenida de microscopio electronico de barrido

Microscopio electronico de transmision-barrida

Microscopio de fuerza atomica

Biopsia por congelación
La técnica de la biopsia por congelación se basa en reemplazar el procedimiento y coloración de las muestras por un procedimiento corto
Pasos principales para realizar una biopsia por congelación
Congelación de la muestra de tejido
Corte del tejido congelado
Tinción de los cortes: la tinción se realiza para diferenciar los núcleos celulares del resto de las estructuras del tejido. Las tinciones de uso más frecuentes para las biopsias por congelación son H-E, azul de metileno y Pas.
Todo el proceso de preparación y evaluación de las biopsias por congelación pueden tardar unos 10 minutos en completarse
Gracias
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